Question

如何验证microRNA靶基因

Answer 1

最近进行课题设计，想验证一下microRNA和预测的靶基因是否结合。同时在靶基因3‘-UTR区的SNP是否影响它们的关系。这个SNP位点在种子区，推测也具有一定功能。第一步想克隆microRNA到表达载体，同时克隆3’-UTR区（包括野生型和突变型）到PGL-3 control 荧光素酶基因下游，双转细胞后，利用荧光素酶报告系统检测两者是否结合，snp位点是否影响结合。
请问具体的实验设计：
1.选取什么细胞系进行实验，是靶基因和miRNA内源表达高的，还是低的。细胞系的基因型是否影响实验结果？
2.我选用的载体是否合适，miRNA如果已有慢病毒的表达载体（商品），是否可以直接利用，还是需要重新做？PGL-3 control是否可以？有无合适的位点供克隆，只发现XbaI。内对照用PGL-TK,因为不是很熟悉这套载体，不知选的是否合适。
3.如果验证成功，还需什么实验佐证，后续的功能研究如何进行？是否也需要用RNAi的方法抑制靶基因表达，再转入野生型和突变性两种基因，看效果？

这个感觉难度较大，也是第一次接触这方面的课题，希望得到诸位高手的指点，谢谢！

Answer 2

最近进行课题设计，想验证一下microRNA和预测的靶基因是否结合。同时在靶基因3‘-UTR区的SNP是否影响它们的关系。这个SNP位点在种子区，推测也具有一定功能。第一步想克隆microRNA到表达载体，同时克隆3’-UTR区（包括野生型和突变型）到PGL-3 control 荧光素酶基因下游，双转细胞后，利用荧光素酶报告系统检测两者是否结合，snp位点是否影响结合。
请问具体的实验设计：
1.选取什么细胞系进行实验，是靶基因和miRNA内源表达高的，还是低的。细胞系的基因型是否影响实验结果？
2.我选用的载体是否合适，miRNA如果已有慢病毒的表达载体（商品），是否可以直接利用，还是需要重新做？PGL-3 control是否可以？有无合适的位点供克隆，只发现XbaI。内对照用PGL-TK,因为不是很熟悉这套载体，不知选的是否合适。
3.如果验证成功，还需什么实验佐证，后续的功能研究如何进行？是否也需要用RNAi的方法抑制靶基因表达，再转入野生型和突变性两种基因，看效果？