Question

求半定量PCR的详细步骤 要详细到每一步喔

Answer 1

研究人员常常需要检测特定基因的表达水平，检测的手段很多，主要有Northern,
半定量RT-PCR,
荧光定量PCR(real
time
PCR),基因芯片的手段。很难用几行字来说清楚这些技术的优缺点。
Northern方式比较直观，但是难以批量进行，劳动量较大；半定量RT-PCR,被一些学员所推崇，因为很多实验室都可以做，但是半定量RT-PCR的关键要保证所有样品的可比性非常困难，内参需要与待检测基因同管扩增，但是由于内参基因表达水平太高，常常抑制检测基因的扩增，常常是分开扩，都可以扩增出来，混在一起就没有了，所以有时不能反映基因表达的实际情况。目的基因和内参基因分开扩增的所谓半定量RT-PCR，没有什么学术意义。荧光定量PCR，在学术界和临床诊断都被广泛采用，该技术能比较真实反映基因的表达水平，实时监控PCR扩增，数据处理自动化和数字化。荧光定量PCR需要采用具有5-3外切酶活性的Taq酶扩增，合成一对普通引物和一条荧光双标记的Taq-Man探针。要准雀体现表达水平，半定量RT-PCR,
荧光定量PCR扩增的循环数比常规少，扩增产物一般都要求处在线性区，如果扩增过程已到达平台区，扩增产物就不能反映基因拷贝数的高低。基因芯片的基本原理和Northern
基本相同，类似于点杂交，都是采用杂交原理，差别是基因芯片一般采用荧光探针，可以同时比较很多样品，可以批量处理和自动化。不足之处是检测设备费用高，假阳性的比较高，需要其他方式予以验证。