Question

DNA测序有哪些方法？

Answer 1

第1 代测序技术
荧光标记的Sanger 法—— 在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。用于测序的技术主要有Sanger（1977）发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法，Sanger测序法得到了广泛的应用。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。 Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
第2 代测序技术
循环阵列合成测序法—— 述第2 代测序技术中, 序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下, 通过读取DNA 聚合酶或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中释放出的光学信号而间接确定的. 除了需要昂贵的光学监测系统, 还要记录、存储并分析大量的光学图像.这都使仪器的复杂性和成本增加. 依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用, 在测序成本中比例相当大. 直接读取序列信息, 不使用化学试剂, 对于进一步降低测序成本是非常可取的.在一个正在发生突破瓶颈巨变的领域内, 很难准确预测未来将发生什么.
第3 代测序技术
直接测序——将基因组DNA 随机切割成大约100 kb 左右的片段,制成单链并与六寡聚核苷酸探针杂交. 然后驱动结合了探针的基因组文库片段通过可寻址的纳米孔阵列. 通过每个孔的离子电流均可独立测量. 追踪电流的变化确定探针杂交在每个基因组片段上的精确位置. 利用基因组片段上杂交探针的重叠区域将基因组片段文库排列起来, 建立一组完整的基因组探针