RT-PCR的原理是什么？有何用途？
原理：利用PCR高度的特异性，通过特定的引物能在复杂样品中得到的特定序列的DNA，而这种特定DNA的产量跟反应初始阶段模板量是直接相关的。简单说来。经过一个PCR循环，可以把一个模板变成两个，在经过一个循环，就会变成四个，以此类推。如果PCR的检测线是1000个产物，那么当你的初始样品中模板是n个，那就需要经历的循环数为 的时候才能检测，这就把循环数与初始样品中模板数联系起来了。也就是说经过计算，达到检测限的循环数就能反映初始RNA样品中某种RNA的含量多少。 在实际中，使用了特殊的含有荧光剂的引物，光学检测相应光强度的产物所需的循环数，能高度灵敏的达到目的。 realtime-PCR有两种。绝对定量和相对定量。 绝对定量常用于逆转录病毒侵染细胞的检测。
用途：通过逆转录，以及taq酶利用HIV的特异引物进行扩增，最终的循环数可以反应你的这群T细胞正在被多少个HIV侵染。 相对定量常用于检测实时的转录谱。
1.逆转录PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录PCR（reverse transcription-PCR, RT-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
2.双链DNA的变性温度是由双链中C+G的含量决定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解温度就越高。在选择的变性温度下，模板链越长变性所需时间就越长。如果变性温度过低或变性时间过短，会使仅仅富含A+T区域变性。当模板DNA的G+C含量超过55%的时需要更高的变性温度。
3.复性过程采用的温度至关重要如果复性温度太高，寡核苷酸引物不能与模板很好的复性，扩增效率将会降低。如果复性温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性的DNA片段的扩增。复性通常在比理论计算的引物和模板的溶解温度低3—5℃的条件下进行。
4.PCR扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。一旦PCR反应进入几何级数的增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因素。从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物，而非特异性的扩增产物应该低到难以检测到的程度。用TaqDNA聚合酶（效率为0.7）在一个含有10的5次方个拷贝的靶序列的反应体系中进行30个循环后往往可以做到上述的理想情况。
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该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
RT-
PCR（Reverse
Transcription-Polymerase
Chain
Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
首先经反转录酶的作用从RNA合成
cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。
用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo
dT
及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
扩展资料
反转录酶的选择
1、Money
鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。
2、禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。
3、Thermus
thermophilus、Thermus
flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4、MMLV反转录酶的RNase
H突变体：商品名为SuperScript
和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
参考资料：百度百科——RT
-PCR
1，最常用的理解：RT
是‘逆转录’（reverse
transcription）的缩写
2，现在也有人这么用：RT是‘实时’（real
time）的缩写
1，先说逆转录PCR：
这项技术使用的‘逆转录酶’来自逆转录病毒，是一种能按照碱基互补配对原则，以脱氧核糖核苷酸为底物，以寡居dT为引物，把mRNA转换成相应DNA的酶，由于该酶的效果与中心法则（DNA所承载的生物信息表达顺序应该是DNA-RNA-蛋白）顺序相反，故而有'逆转录'之称。
由于逆转录反应使用了引物和模板，也是聚合酶链式扩增的（PCR是‘链式扩增反应’polymerase
chain
reaction
的缩写）故称为RT-PCR。
再说其用途：
我们提取的RNA主要是rRNA，即核糖体RNA，但很少有人用它做些什么，倒是含量较少的mRNA，即信使RNA是中心法则所述的遗传信息表现的中转站，所以我们要把微量的信使RNA搞出来，更重要的是，RNA太容易分解了，环境中无处不在的RNA酶啊，以及其容易被水解的特点啊，让你不得不尽快把珍贵的信使RNA转化成稳定的形式，于是就有了RT-PCR。
2，
再说实时PCR
细胞瞬时转录的mRNA种类颇多，各种mRNA含量也有实时的改变，这反映了细胞核内转录因子根据环境要求在做出相应的变化，realtime-PCR，以及quantitative
realtime-PCR
（简称qRT-PCR）就应运而生。
原理：利用PCR高度的特异性，通过特定的引物能在复杂样品中得到的特定序列的DNA，而这种特定DNA的产量跟反应初始阶段模板量是直接相关的。简单说来。经过一个PCR循环，可以把一个模板变成两个，在经过一个循环，就会变成四个，以此类推。如果PCR的检测线是1000个产物，那么当你的初始样品中模板是n个，那就需要经历的循环数为
的时候才能检测，这就把循环数与初始样品中模板数联系起来了。也就是说经过计算，达到检测限的循环数就能反映初始RNA样品中某种RNA的含量多少。
在实际中，使用了特殊的含有荧光剂的引物，光学检测相应光强度的产物所需的循环数，能高度灵敏的达到目的。
realtime-PCR有两种。绝对定量和相对定量。
绝对定量常用于逆转录病毒侵染细胞的检测，比如你想知道有多少HIV侵染了样本中的T细胞，你可以收集一定数量的T细胞并提取RNA，通过逆转录，以及taq酶利用HIV的特异引物进行扩增，最终的循环数可以反应你的这群T细胞正在被多少个HIV侵染。
相对定量常用于检测实时的转录谱，例如在给药前后，某重要基因转录的实时变化，可以分别收取给药前后的全RNA，用相对转录量不变的基因为内参，如GAPDH或beta-actin，与目标基因转录的转录量对比，来定量反应药物对目的基因转录含量的影响。一气呵成，难免有错，看着玩吧
