Question

用革兰氏阳性菌做菌落PCR时，怎样处理菌体模板？

如题，本人刚刚开始做分子生物学方面的研究，因为大家都知道G+的胞壁比G-菌比如E.coli的要厚些，所以要在PCR之前要对模板进行一定的处理，但是怎样处理才好？我上次做的时候就挑去单菌落（猪链球菌2型）溶30微升水后用95°处理10min，然后取了5微升做模板加到PCR体系里去了，做完PCR跑胶检测的时候没有带，我觉得是我在处理模板的时候没处理好导致的，因为其他试剂都是刚买的，请各位有经验的指点一下我这个新手，步骤最好说的详细一些，多谢了！！

Answer 1

为什么不抽基因组？抽出来的模板你可以用好多次。煮沸法模板有效期短，提取的效率也很低下，干扰PCR的杂质也多。就像你PCR失败一样，不一定是模板中没有DNA，也可能是杂质干扰的结果。

如果样本只是一个菌，或者不是很多，建议少量提取基因组，这样的模板是不会有问题的。至少，包括我在内我所有见过的做过这个实验的人都没有失败过。

如果样本很多，非得要煮沸法的话你这样做：
不要用PCR仪95℃处理，用液体培养基离心获得菌体，除去培养基，无菌水悬浮，沸水浴30min，迅速-20℃冰冻，化冻后8000rpm离心以沉淀细胞碎片，取2μL上清作为PCR模板。

如果你非要用PCR仪处理，也行，37℃溶菌酶预处理30min。

如果我说的你都不想做，那么请把你的模板用量减少到2μL（我指的是对于50μLPCR体系来说），说不定是杂质太多导致你PCR失败。