Question

拟南芥基因组提取过程中对PCR有影响的试剂

我是用粗提的方法提基因组进行PCR，检测T-DNA突变体，方法如下：
1、剪取拟南芥新鲜叶片，放入加有400μl预冷DNA提取液的EP管中；
2、加20μl 10%SDS,研磨；
3、离心8分钟；
4、取上清，加400μl酚：氯仿（1：1），静置10分钟后，离心10分钟；
5、取水相，加400μl异丙醇，静置15分钟后，离心15分钟；
6、弃上清，加400μl 75%乙醇洗涤，离心5分钟；
7、弃上清，待乙醇完全挥发，加10μl双蒸水，即为模板。
之后按比例加PCR体系中的其他成分，混匀，分装，加模板。

我就是按这个方法操作的，但结果总是不稳定，PCR产物电泳条带亮度有时不理想。而且不是其中几条，而是总体的很弱。不是都亮，就是都弱。我有一次把模板的量有1μl提到2μl，那一次结果很好，可后来还这样做也重复不出来了......
是基因组提取过程中有什么试剂对PCR有影响我没注意到吗?请学长、学姐不吝赐教~

Answer 1

我觉得是你的提取方法和PCR体系有问题

DNA提的不好，另外你用的是RAPD还是什么？RAPD不稳定

拟南芥实验室常用，提取DNA的方法已经很成熟了，你可以尝试换一种方法。

还有一个可能就是枪不准

Answer 2

乙醇一定要完全挥发。不然会影响后续酶活。

PCR 不亮，看来还是你的模板量少了。因为你把模板加倍成功过！可能多加点叶片会好一些。