Question

Trizol法提取RNA及RNA纯度判断

Answer 1

Trizol可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，同时使RNA酶变性失活，保护RNA的完整性。Trizol的主要成分为异硫氰酸胍、酚和B-巯基乙醇，异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
提取中加入氯仿，主要用处是用来分相，加速有机相和水相的分层，上层为水相，PH 5.1左右，只有RNA分子留在水相，DNA分子沉淀在酚与溶液的界面。加入异丙醇，主要沉淀大分子rRNA和mRNA。最后加入乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白，去除杂质。

判断RNA 的质量主要有两个标准，一是完整性（是否被降解），二是纯度。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现28S、18S和5S rRNA对应的条带，如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带。
完整性的图片大致如下图所示：

RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260／A280值来判断。蛋白中trp、tyr、phe的吸光度为280nm，所以 280nm常用来表示蛋白质吸光度；而260nm为DNA的吸光度。

理论上， 纯的RNA情况下：OD260/OD280的值为2，纯的DNA情况下：OD260/OD280的值为1.8.

OD260反映的是溶液中核酸的浓度，OD280反映的是溶液中蛋白质或者氨基酸的浓度。

样品中如果含有蛋白质及苯酚，A ₂₆₀ /A ₂₈₀ 比值会明显下降。对于纯的样品只要读出260 nm 的A值即可以算出含量。通常以A值为1相当于50微克/ml 双螺旋DNA，或者40微克/ml 单链DNA（RNA），或者20微克/ml 寡核苷酸计算。

OD260/OD280=1.9~2.0 RNA居多，纯度已经很高了。

纯DNA：OD ₂₆₀ /OD ₂₈₀ ≈1.8(>1.9，表明有RNA污染；<1.6，表明有蛋白质、酚等污染）

纯RNA：1.9 <OD ₂₆₀ /OD ₂₈₀ <2.0（2.0时表明可能有异硫氰酸残存）

提取前需要准备：
75%的乙醇（提前于-20冰箱保存）、氯仿、RNAase-free water、1.5ml Eppendorf离心管、Tips（RNAase-free）。
需要特别注意的是 一定要带好手套和口罩，做好个人防护工作！！！并且也可以防止RNA降解

步骤：
（1） 培养细胞： 收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。
（2） 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入0.8~1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min。
（3）按200ul氯仿/ ml Trizol的量加入氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。注：剧烈震荡使基因组DNA断裂。
（4）4℃离心，12000rpm，15min。注：离心后分为三层，下层为红色的苯酚—氯仿层，中间层和上层的水样层，RNA存在于水样层中。若只提RNA，千万不要吸取中间层和下层酚—酚相，可保存于4℃冰箱。
（5）将上层水相转移至另一个EP管中，加入等体积的异丙醇并混匀(约500ul)，室温放置10min或者-20冰箱沉淀2h，也可以-20冰箱沉淀过夜。
（6）4℃离心，12000 rpm，10min，用枪头小心吸走液体，RNA沉于管底。
（7）用0.5ml 75%冰乙醇洗涤RNA沉淀，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
（8）4℃离心，8,000rpm，5min。重复两次。弃去乙醇后，室温干燥RNA沉淀5-10min。
（9）可用50ul H2O溶解RNA样品，55-60℃ 溶解5-10min，保存于-80℃。

所得RNA可以继续用于下游实验。