Question

实验1：总RNA的提取——Trizol

Answer 1

实验一：细胞中总RNA的提取及鉴定

一、目的：
掌握Trizol提取总RNA的原理和步骤，学习电泳鉴定总RNA的方法。
二、原理：
RNA是核酸，具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。
常用的试剂为Trizol，该试剂可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，同时使RNA酶变性失活，保护RNA的完整性。Trizol的主要成分为异硫氰酸胍、酚和B-巯基乙醇，异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。提取中加入氯仿，主要用处是用来分相，加速有机相和水相的分层，上层为水相，PH 5.1左右，只有RNA分子留在水相，DNA分子沉淀在酚与溶液的界面。加入异丙醇，主要沉淀大分子rRNA和mRNA。最后加入乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白，去除杂质。
判断RNA 的质量主要有两个标准，一是完整性（是否被降解），二是纯度。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现28S、18S和5S rRNA对应的条带，如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260／A280值来判断。
三、步骤：