Question

影响实时荧光PCR的因素有哪些？

Answer 1

影响荧光PCR的因素很多，但从操作和技术上来讲应该要注意一下几点：
1.
RNA的完整性
因为RNA一旦降解所定量的结果就不能正确反映样品中mRNA的量，所得的结果也是错误的。所以在RNA提取过程中要严格遵守操作规范，避免RNA酶的污染。
2.
RNA样品中的基因组DNA污染
提取的RNA样品中不可避免地混有少量的基因组DNA。基因组DNA对试验有两个影响：一是影响对RNA的精确定量；二是影响PCR扩增的特异性。
3.
PCR反应体系的优化
PCR扩增过程必须保证扩增产物只有特异的目标产物，为此，首先要保证PCR反应体系达到最优。目前许多公司都有用于实时定量PCR反应的试剂盒，可以方便PCR反应的操作。
4.
反转录
反转录所得cDNA的量必须精确地等于相应的mRNA的量，反转录对于实时定量PCR来说是非常关键的一步。目前常用的反转录酶有2种：AMV-RT和MMLV-R。反转录常用的引物有随机引物、Oligo-dT和特异引物。相比之下Oligo-dT和特异性引物更适合实时定量PCR。
5.利用实时定量PCR研究基因表达时，一般用相对定量的方法相对定量必须用到内标基因。可靠的内标基因应是在不同细胞类型、不同试验条件下都稳定表达的持家基因。常用的内标基因有β-tublin、actin、
GAPDH、18sRNA、efla和Cyclophilin等。尽管在大多数情况下这些持家基因的表达非常稳定，但是
最近有报道认为这些持家基因的表达在某些情况下会发生变化。也就是说并不是任何内标基因都适合
任何试验。在选择内标基因时，应仔细考虑各种因素，选择合适的内标基因或内标基因组合。