菌落PCR的具体方法
1、菌落PCR混合液（通俗称为pcr mix）的制备
Taq buffer（10×） 180ul
dNTP（2.5 mM） 20～25 ul
Primer Forward（引物浓度在10Pmol） 5 ul
Primer Reverse（引物浓度在10Pmol） 5 ul
ddH2O 720 ul
Taq（2U/ul） 12～15 ul
2、常温下随机挑选平板内的单一菌落，用灭菌的牙签或枪头挑取单一菌落（强调单一，不能是双克隆），在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的PCR8联管中或者96孔pcr反应板中（96孔反应板和挑选的菌落做好记号，如平板上点的是1#，2#，3#……则96空反应板也相应标1#，2#，3#……以便筛选到克隆后的扩大培养），再将挑取的96个单一菌落转移到48孔板培养基中培养，挑好单克隆菌落转移之后，由于96孔反应板内沾有挑选的菌落，可以用相应的通用引物和之前配制好的PCR混合液混合好之后加入到96孔反应板内。
3、将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。
4、在扩增出来的反应液中加入溴酚蓝或是其他染料，电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。
5、将已经筛选到的阳性克隆对应96孔反应板上的菌株挑选出来，37度继续培养达到一定时间可以抽提质粒，测序验证是否是需要的目的基因
注意事项：设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。
使用的引物浓度不能太高，浓度过高会导致非特异性扩增，反应的循环数也不能太多，一般不超过25个。同时因为扩增的片段的GC含量问题，有的GC含量很低，有的又很高，导致菌落PCR不容易扩增出目的条带，在此建议在设置PCR程序时以高GC的温度为上限，每一循环降0.2度左右。
48孔板 96孔反应板
