Question

质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图该怎么分析

Answer 1

一、实验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳 二、实验原理： 1.质粒DNA的提取： 质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ 、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。 （1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理： 碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA，达到分离提纯质粒DNA的目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分离。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中；而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。SolutionⅠ 、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。 （2）四种溶液作用及原理： ①Solution I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制DNA酶对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。 ②Solution II的作用：提供碱性条件，pH高达12.6，使大肠杆菌瞬间裂解，促使染色体DNA和质粒DNA变性。所含离子型表面活性剂十二烷基酸钠（SDS）可使细胞膜、核膜发生破裂，充分溶解膜蛋白。同时，磺酸基与蛋白质形成复合物而变形沉淀。 ③Solution III的作用：为KAc-HAc缓冲液。该溶液所含有的高浓度钾离子与溶液体系中的十二烷基磺酸钠发生反应形成十二烷基磺酸钾，从而将与之结合的绝大部分大肠杆菌蛋白质以及很长的基因组DNA一起沉淀，与质粒分离开来；另外溶液III所含有的醋酸中和溶液Ⅱ的强碱性，使pH降至中性，因为长时间的碱性条件会打断DNA；基因组DNA一旦发生断裂，只要是50-100kb大小的片段，就没有办法再被PDS共沉淀，这样就跟质粒DNA共存了。而且在整个质粒DNA的提取过程中，沉淀DNA时用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行都是为了用化学或物理手段将基因组DNA分子和蛋白质发生变性、在体系中的溶解度降低，较充分的分离提纯出实验所需的质粒DNA