Question

重叠PCR引物怎么设计

Answer 1

巢式PCR一般是有两对引物的，一对outer引物，一对inner引物。一般建议为了方便，inner引物直接根据目标序列来设计引物（和普通PCR引物设计方式一样），而outer引物则从目标序列前后两端的序列开始设计，也就是说上下游各往前后移动一些碱基开始设计引物。outer和inner引物的设计应含有重叠区域，重叠区域一般为10bp比较合适。如果说你手上只有目标序列，没有目标序列前后的序列信息的话，你可以使用普通引物作为outer引物，之后再从序列内部设计一对inner引物，原则和之前也是一致的，也应含有10个碱基左右的重叠区域。这时候，因为你的inner引物PCR后产物会少一些碱基序列，你可以设计第三对引物，这对引物为outer和Inner引物的拼接序列，然后进行PCR，将缺失的碱基人工补上。