Question

请教：如何提取细胞内的蛋白并定量

Answer 1

一般来说检测细胞内的蛋白质需要破碎细胞，非结构蛋白较易提取，破碎细胞后离心取上清即可。而结构性蛋白则需破碎脂膜提取蛋白，具体方法可参照膜蛋白提取的相关文献。提取的总蛋白需定量，然后以每mg或g的蛋白的相同浓度稀释后用于测定。提取时注意要保持低温及加入必要蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)。
可以，这个和western定量的原理类似，需要有标准品来作比对。不过很难。因为流式主要是用来最相对量的比较的。
细胞内的蛋白，用荧光标记的单克隆抗体识别后，用流式可以测出每个细胞的相对荧光强度。有一种特异性的微球，可以吸附一系列不同定量分子数的抗体。这种微球吸附同样的荧光抗体，可以做出荧光强度和所吸附抗体分子数量的标准曲线。然后拿细胞检测的荧光强度和这个标准曲线对比，得到细胞内所结合的抗体数。因为单克隆抗体只结合相同的抗原表位，所以可以推算出细胞内蛋白的分子数量了。
解释结果的时候要考虑到抗体的特异性和染色的效果等影响因素。