Question

Western Blot原理技术

Answer 1

Western blot (蛋白印迹)

WB是一种把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持物(NC膜或PVDF膜)，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测。WB采用抗体作为探针，抗体可以与附着在固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生抗原-抗体免疫反应。这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物(即总蛋白混合物)中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析，旨在鉴别特异性蛋白的类型(如亚型、聚体、剪切体等)和蛋白表达量的变化。

其基本流程如下：

前面·我们已经介绍过SDS-PAGE，电泳完成后如果要进行western blot则需要转膜

转膜：转膜有湿转和半干转两种不同方法。我用的是半干转移法，膜覆盖住胶，膜用balance buffer润湿（甲醇溶液）,盖子分别用top buffer和bottom buffer润湿后盖住，转膜10min。

注意：

1：膜大小合适，防止浪费.

2：盖好膜和凝胶后，凝胶、膜 推平，否则会导致转膜不完全。

3：注意一定要戴手套或塑料镊子接触膜，避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率。

封闭：降低背景，占据膜上剩余的结合位点，使抗体只能与膜上的抗原特异性结合，一般用的是5%的脱脂奶粉，但值得注意的是对于磷酸化的抗体或生物素标记的抗体不能用脱脂奶粉，只能用5%的BSA。封闭时间室温1-2h。

一抗孵育：封闭结束后，用PBST稍微洗膜后倒掉，再加入PBST摇10min，反复洗三次后加入0.5%一抗+3%奶粉进行孵育2h，一般5mL，但上次我用10mL。一抗孵育时，要注意一抗的种属来源，我用的his标签，所以一抗是anti-his。一抗可以反复使用2-3次。

PBST 溶液  PBS 溶液中加入 0.1%吐温

洗膜：用PBST进行洗膜，10min/次，洗3-4次即可。

二抗孵育：洗膜结束后，后加入0.3%二抗+3%奶粉5mL孵育1h，再次洗膜。注意二抗的种属要与一抗的来源相对应，例如我的一抗是鼠抗，我的二抗是羊抗鼠。

检测：按 1：1 比例吸取显影液中的 A 液和 B 液于 1.5 mL EP 管中混合，一块胶100μL，后将混合液均匀滴加在 PVDF 膜上，用塑封袋将 PVDF 膜封好，放入显影仪中进行显影 (速度要快，尽量减少底物消耗)。