双脱氧末端终止法测序的基本步骤包括哪些
以双链DNA测序为例，双脱氧末端终止法的基本步骤包括：变性双链模板的制备和延伸和终止反应。
1、变性双链模板的制备
① 取1.5ml处于对数生产期的培养菌液（含有待测病毒核酸的重组质粒模板），离心除去上清液后，用150ml Tris/葡萄糖缓冲液重悬菌团，在室温下放置5分钟。
② 加入300ml的1%SDS，0.2mol/L NaOH，颠倒混合约15次，在室温下放置15分钟，加入225ml 3mol/L醋酸钠（pH4.5），颠倒约15次混合，在冰浴中放置45分钟，离心5分钟。
③ 将650ml上清液转移至一支新管中，加入650ml异丙醇，混合后在室温下放置10分钟，离心5分钟后弃去异丙醇，抽真空干燥沉淀。
④ 用125ml TE(pH 8.0）重新溶解DNA，加入375ml的4mol/L LiCl，在冰浴中放置20分钟后，于4℃下离心5分钟。
⑤ 将上清液转移至一支新管中用饱和苯酚抽提后再用氯仿抽提，加入2倍体积的异丙醇，在室温下沉淀30分钟，离心5分钟，弃去上清液。
⑥ 用冰冷的70%乙醇洗沉淀，离心5分钟，弃去上清液并干燥，用50ml TE缓冲液重新溶解沉淀。用紫外分光光度计测定质粒DNA含量。
⑦ 取0.2mg质粒DNA，并将体积调至9ml，加入1ml 2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA，在室温下放置5分钟，加入2ml 30mol/L醋酸钠（pH 4.5）和8ml水。
⑧ 加入6ml冰冷无水乙醇，混合后在干冰/乙醇浴中放置15分钟，在4℃下离心5分钟，小心地弃去上清液，用冰冷的70%乙醇洗沉淀，离心5分钟并小心地弃去上清液，真空抽干沉淀，并用TE缓冲液重新溶解沉淀。
2、延伸和终止反应
以利用T7DNA聚合酶进行的双脱氧链终止反应为例。
① 取4支0.5ml小离心管，标上G、A、T、C，每管加入7ml变性的双链DNA模板（分别为1和2mg），1ml寡核苷酸引物和2ml 5×测序缓冲液混合，65℃保温2分钟，在室温下冷却30分钟。
② 每管加入1ml 0.1mol/L DTT，2ml 1.5mol/L 3种dNTP混合物，0.5ml32P dATP和2ml（2IU）修饰的T7DNA多聚酶混合物，在室温下放置5分钟。
③ 按标记每管分别加入3ml 4种ddNTP终止混合物的一种。
④ 短促离心后，在37℃下保温5分钟。
⑤ 加入5ml甲酰胺上样缓冲液，上样前在80℃下加热2分钟，并迅速置于冰浴上，每个样品取3ml，上样电泳。
⑥读取合成链的核苷酸序列。
扩展资料
延伸和终止反应中测序反应物电泳和序列读取的注意事项：
（1） 按普通聚丙烯酰胺凝胶制作方法制作梯度胶。
（2） 按G、A、T、C次序加入每种样品，在G、A和T各泳道上样1ml，而在C泳道上样1.5ml。
（3） 上样完毕加压1700V电泳，根据样品中溴酚蓝和二甲苯青染料迁移情况确定电泳时间。
（5） 在60℃或80℃干燥30分钟后，放射自显影读取序列。
参考资料来源：百度百科-双脱氧链终止法
迈杰
2024-11-30 广告
在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。
双脱氧链终止法 是现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger等1977年提出。
其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
(一) Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序 操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。
1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。
2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP，例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。
3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。
4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP)，则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。
5.放射自显影。根据四泳道的编号和 每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。
