Question

写出Sanger法DNA测序的基本原理和过程。

Answer 1

【答案】：Sanger法DNA顺序测定技术的基本原理，是在反应中加入一种2'，3'-二脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，此物质因没有3'-OH，所以不能进行脱氧核苷酸链的延长。整个测定的程序如下：
(1)将被测DNA制成单链模板。分别加入4个反应管中。并在每个管中加入引物、DNA聚合酶和4种dNTP(其中一种为³²P标记)。
(2)在4个管中分别加人ddTTP、ddCTP、ddGTP和ddATP，保温。
(3)反应结束后在4个管中分别形成一些全部具有相同5'-引物端和分别以ddT、ddC、ddG、ddA 残基为3'-端结尾的一系列长短不一的混合物。
(4)每种混合物经变性聚丙烯酰胺电泳分离及放射自显影，可见4种混合物形成不同的电泳迁移条带。每一条带都代表着一段以ddNTP终止的片段。只要按照电泳条带出现的先后次序即可读出被测DNA的顺序。
Sanger法从引物的3'-端开始能合成约300个核苷酸的排列顺序，是现今分子生物中最重要的手段之一。