质粒的提取方法
从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等。
在氢氧化钠（pH12.0-12.6碱性环境）和去污剂SDS的作用下，细菌蛋白质变性，细胞破裂，细菌染色体DNA变性，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变形。
但由于质粒DNA相对分子质量较小，公价闭环的DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态，呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会完全分离。
将pH调至中性并有高盐存在的条件下，变性质粒DNA又恢复到原来的构型，而大部分染色体DNA和蛋白质难以复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。
通过离心沉淀，细胞破碎、染色体DNA及大部分蛋白质等可被出去，而质粒DNA及相对分子质量较小的RNA仍为可溶状态。混杂的RNA可用RNA酶消除，再用酚／氯仿处理，可除去残留蛋白质。在盐和乙醇存在的条件下，进一步离心沉淀质粒DNA。
扩展资料
分类：
根据质粒能否通过细菌的接合作用，可分为接合性质粒和非接合性质粒。接合性质粒带有与接合传递有关的基因。非接合质粒在一定条件下通过与其共存的接合质粒的诱动或转导而传递。
根据质粒在细菌内的复制类型可分为两类：严紧控制型和松弛控制型。严紧控制复制型质粒的复制酶系与染色体DNA复制共用，只能在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体停止复制时，质粒也就不再复制。
松弛控制复制型的质粒的复制酶系不受染色体DNA复制酶系的影响，在整个细胞生长周期中随时都可以复制，在染色体复制已经停止时质粒仍能继续复制。
根据质粒的不相容性，可分为不相容性和相容性。不相容性指结构相似、密切相关的质粒不能稳定地共存于同一宿主细菌内的现象，反之为相容性。常用于流行病学的调查。
参考资料来源：百度百科-质粒抽提
利穗科技
2024-04-23 广告
从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circularDNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子，称开环DNA(Open circularDNA，简称ocDNA）；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(LinearDNA）。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。
假设，你说的对照是阴性对照的话，首先第一个，
1，这个结果就是不对的，对照组出现菌落，说明你的抗生素失效了，实验无效。
2.的话说明你的转化没有成功，实验操作跟试剂没问题
3.实验成功，可以挑取单克隆摇菌
假设你说的对照组做的阳性对照
那么
1.实验成功，可以进入下一步
2.试剂或者操作有问题，导致阳性对照都做不出来
3.这个实验结果没法接受，不合常理，重新再转化
另外，一般做转化，会正反对照都做，阳性对照+阴性对照。
2. 取30mL菌液，置于50mL离心管中，4000rpm 离心5 min，彻底弃除上清。
3. 加入5ml溶液A，充分振荡2分钟，使菌体充分悬浮，确保无絮块存在，转移到15mL离心管。4000rpm离心5min，彻底弃除上清。
4. 加入1ml溶液I和50ul溶液B，充分振荡2分钟，使菌体充分悬浮，确保无絮块存在。
5. 加入2ml溶液II，盖紧管盖，轻轻颠倒混匀6次，注意整个管子的内表面均需与溶液II接触，室温放置至溶液清亮。（一般为4-5min，如5min后溶液未变清亮，说明细菌过多，应考虑减少菌液量。注意混匀手法要温和，不要剧烈混合。溶液II取液后应尽快旋紧管盖。）
6. 加入1.5ml溶液III，盖紧管盖，立即轻轻颠倒混匀8次，4℃放置5min。（此步注意要尽快混匀，但手法要温和）
7. 4℃、10000rpm离心15min，小心吸出上清，轻移至新的15ml离心管。（应在离心机自动停转后取出离心管，以免沉淀悬浮）
8. 加入2.5ml异丙醇，充分混匀。（在此期间，准备富集装置）
9. 将富集吸附柱放在抽滤装置上，再将10mL无菌注射器针筒插入富集吸附柱上端，将上述溶液转入针筒内，真空抽滤至富集吸附柱内液体刚刚抽滤完毕（约2-10分钟，注意不要抽滤太干，太干不利于后续步骤开展）。
10. 向针筒内加2mL 洗涤液A，静置2分钟，真空抽滤至富集吸附柱内液体刚刚抽滤完毕（约1-5分钟，注意不要抽滤太干）。
11. 向针筒内加1mL 洗涤液B，抽滤2 分钟。同时，按每份样本30μL 取洗脱液（如10份提取样本，即取300μL 洗脱液），放置于灭菌1.5mL离心管，65℃预热。
12. 将富集吸附柱放入收集管内，加入0.6 mL无水乙醇，静置2分钟，12,000 rpm 离心1分钟，弃去收集管内的废液。
13. 将富集吸附柱放入收集管内，12,000 rpm 离心2 分钟，离去残留的乙醇。开盖，室温放置3分钟。
14. 取出富集吸附柱，放入新的1.5mL灭菌洁净离心管内，加入30 μL 预热的洗脱液，静置2分钟，12,000 rpm离心2 分钟，收集DNA溶液。
BIOG去内毒素中大量质粒富集提取试剂盒注意事项：
1、 单只富集吸附柱质粒负载量在60ug左右，提取的菌液量应根据所含质粒量进行选择，如预估1mL菌液可提质粒2ug，则单个提取套装提取菌液不要超过30mL，如菌液较多，可分2管或多管进行。
2、 溶液II含碱性物质，洗涤液A含内毒素清除因子，取液完成后应立即旋紧管盖，密封保存。
3、 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。 如所提质粒为低拷贝质粒或者大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加溶液I、溶液B、溶液II、溶液III、异丙醇等的用量。
4、 所用洗脱液的最小体积为10 μL，可根据所提质粒的预估量和期望达到的质粒浓度选择合适的洗脱液用量，如预估提取的质粒量为40ug，期望的质粒浓度为2ug/uL，则选择20μL洗脱液进行洗脱。
