Question

microRNA的茎环引物及其PCR扩增的上游引物怎么设计？

茎环引物设计时是单链序列，发这个序列给公司合成后，做实验时会自动成环吗？不需要特殊说明或加工，直接把这个单链序列发给公司就行吧？还有我看到一篇文献上，接下来PCR的上游引物除了包含microRNA的部分序列外，还在前面加了几个碱基，这个依据到底是什么呢？具体怎样设计这个上游引物呢？

Answer 1

合成的单链在实验时又一个和模板结合的退火过程，在这个过程中会自动形成茎环结构，如果你的茎环结构设计合理的话。
我也在类似文献上看到过上游引物含有额外的碱基，上面有说明的，是为了调整Tm值。
上游引物不能全覆盖miRNA，5‘-增加几个碱基后Tm值和下游引物相对应，可以再用软件检查，避免非特异性结合
一般自己设计这种miRNA的RT-PCR引物需要不断优化，一次成功的机会较小，要做好心理准备。可以选择试剂盒

Answer 2

茎环引物直接发序列给公司合成就好了，不用加说明或加工。上游引物加几个碱基可以延长扩增出来的产物的长度，一般PCR扩增目的片段不都有长度限制吗，太长太短都不好。依据应该都是参考文献的。上游引物的设计就是microRNA 5·端的一段序列。

Answer 3

microrna的茎环引物可以自己设计。据说有公司也可以帮忙合成，不过还是自己设计好了发过去比较省钱吧。内参一般是u6，因为它长度和microrna一样比较短。我做的反转录内参是跟microrna分开管子转的real-time
quantification
of
micrornas
by
stem–loop
rt–pcr
这篇文献上有比较容易看懂的茎环引物的图。也可以看看几篇相关的中文文献都有。