Question

免疫分析方法有哪些？

Answer 1

（1）放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）。RIA技术是使用以放射性同位素（如125I、32P、3H等）作标记的抗原或抗体，用γ－射线探测仪或液体闪烁计数器测定γ－射线或β－射线的放射性强度，来测定抗体或抗原量的技术。它包括以标记抗原为特点的放射免疫分析和以标记抗体为特点的免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）。前者以液相竞争结合法居多，既测大分子抗原又测小分子抗原；后者以固相法测大分子抗原为主。

RIA在早期建立的农药免疫分析方法中占了很大比重，建立了狄氏剂、艾氏剂、2，4－D和2，4，5－T、对硫磷和百草枯等农药的放射免疫分析法。尽管该方法灵敏度非常敏锐（RIA通常为10-9g、10-12g，甚至10-15g），应用范围广，但进行RIA需使用昂贵的计数器，也存在放射线辐射和污染等问题，因此在农药残留检测领域的应用和发展受到了一定的限制，并逐步为其他免疫分析方法所取代。

（2）酶免疫分析法（enzymeimmunoassay，EIA）。EIA是继RIA之后发展起来的一项免疫分析技术。其检测原理与放射免疫法类似，但所用的标记物为酶，它将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来，通过测定结合于固相的酶的活力来测定被测定物的量。用做标记物的酶有辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）和碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）、葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GO）、脲酶（urease）等。酶标记反应的固相支持物有聚苯乙烯塑料管、膜等。目前大多数采用96孔酶标板（MTP）作为固相支持物。这种板的检测容量大，样本数量多，只需有台简单的酶标仪就可得出准确的检测数据。也有学者采用磁珠作为固相材料进行EIA研究，其原理是将高分子材料（聚苯乙烯、聚氯乙烯等）包裹到金属小颗粒（Fe2O3，Fe3O4）外面，再通过化学方法键合上氨基（－NH2）、羧基（－COOH）、羟基（－OH）等活性基团，再与抗体或抗原耦联，制成免疫性微珠。该方法的优点是微珠比表面积大，吸附能力强，能悬浮在液相中快速均匀的捕获样品中的待测物，通过外加磁场后能够实现微珠与样品液的快速分离，从而减少检测时间、提高检测灵敏度。

由于酶标试剂制备容易、稳定、价廉，酶免疫分析的灵敏度接近放射免疫技术，故近年来EIA技术发展很快，已开发了多种EIA方法。其中酶联免疫法（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）是目前农药残留检测中应用最广泛的酶免疫分析技术。

（3）荧光免疫分析法（fluorescenceimmunoassay，FIA）。FIA检测的基本原理是将抗原抗体的高度特异性与荧光的敏感可测性有机地结合，以荧光物质作为示踪剂标记抗体、抗原或半抗原分子，制备高质量的特异性荧光试剂。当抗原抗体结合物中的荧光物质受到紫外光或蓝光照射时，能够吸收光能进入激发态。当其从激发态回复基态时，能以电磁辐射形式放射出所吸收的光能，产生荧光。绘制农药浓度－荧光强度曲线，可以定性、定量检测样品中的农药残留量。

适用于抗体、抗原或半抗原分子标记的荧光素须符合要求：①应具有能与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团，或易转变成这类反应形式而不破坏其荧光结构；②标记后，荧光素与抗体或抗原各自的化学结构和性质均不发生改变；③荧光效率高，与蛋白质结合的需要量很少；④荧光素与蛋白质结合的过程简单、快速，游离的荧光素及其降解产物容易除去；⑤结合物在一般储存条件下性能稳定，可保存使用较长时间。

（4）化学发光免疫分析法（luminescentimmunoassay，LCIA）。LCIA又可分为化学发光免疫测定（chemiluminescentimmunoassay，CLCIA）和生物发光免疫测定（bio-luminescentImmunoassay，BLCIA）。

1976年，Shroeder首先用生物素（B）－亲和素（A）系统建立了均相化学发光免疫测定技术，尔后Halman和Velan又将其引伸到非均相体系，现已渗入到生物学研究的各个领域。其原理是以发光指示抗原与抗体的结合，当发光标记物与相应的抗体或抗原结合后，底物与酶作用，或与发光剂产生氧化还原反应，或使荧光物质（例如红荧烯等）激发，释放光能。最后用光度计测定其发光强度，进行定量分析。常用发光标记物有辣根过氧化物酶（HRP）、鲁米诺（luminol）、异鲁米诺（isoluminol）、咯粉碱（lophine）、光泽精（lucigen）、双（2、4、6－三氯苯）草酸酯、联苯三酚和6[N-（4－二氨基丁基）－N－乙基]－氨基-2，3－二氢吩嗪-1，4－二酮（ABEI）等。用上述发光标记物标记的抗体（或抗原）在一定的pH缓冲溶液中与相应的抗原（或抗体）结合时，在协同因子（例如H2O2等）的作用下发光，其发光强度与被测物的浓度成正比，故可以用于定量分析。

发光免疫测定具有特异性强、灵敏度高（检测限量达10-15mol/L）、快速（1～3h）、发光材料易得等优点。但其发光过程和强度常受到发光物质本身的化学结构、介质的pH、协同发光物质和金属离子杂质等影响。

（5）金免疫层析分析法（goldimmuno-chromatographyassay，GICA）。GICA检测原理是将配体（抗体或抗原）以线状包被固化于硝酸纤维素膜等微孔薄膜上，胶体金标记另以配体或其他物质并以干态固定在吸水材料上，通过毛细作用，使样品溶液在层析条上泳动，当泳动至胶体金标记物处时，如样品中含有待检受体，则发生第一步高度特异性的免疫反应，形成的免疫复合物继续泳动至线状包被区时，发生第二步高度特异性的免疫反应，形成的免疫复合物被截留在包被的线状区，通过标记的胶体金而显红色条带（检测带），而游离的标记物则越过检测带，与结合的标记物自动分离。通过检测带上颜色的有无或色泽深浅来实现定性或定量测定2。

2金标试纸条检测

GICA法具有快速（5～20min）、廉价、结果明确、无需复杂操作技巧和特殊设备、携带方便等优点。但相对于其他免疫分析方法，该方法检测灵敏度稍低，主要适合现场快速定性或半定量测定。目前该方法已被应用于医学和生物学等众多研究领域，尤其在发达国家已经得到了广泛的应用。

（6）免疫分析与仪器分析技术的联用技术。使用单一的IA技术进行农药残留分析获得的信息量少，而理化分析方法的选择性又比较差。Kramer等人将免疫分析法和液相色谱法（LC）联合起来使用，从而简化了分析方法，提高了检测效率。LC-IA的联用，将LC的高分离能力和IA的高灵敏性和高特异性融为一体。该分析法尤其适合多组分残留分析和微量分析。免疫分析与气相色谱/质谱（GC/MS）的联用可减少结构相似的农药或代谢产物分析中的交叉反应，以降低假阳性。