Question

请教线粒体提取的几个问题

1、做液闪仪测心肌细胞线粒体ANT转运酶活性检测，请问有没有非超声破膜的方法（没超声破碎仪）？2、若提得线粒体，如何看它有没有活性呢，用詹那绿B 就可以么？3、液闪仪大概需要多少样本量？

Answer 1

博凌科为解答：提取新鲜心肌组织细胞内线粒体的方案：1、心肌组织切碎后在4 ℃介质（0.25 mol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl pH7.4，0-4℃）中制备心肌组织匀浆。匀浆经750g、离心10 min后留上清，以9000 g离心20 min 后留沉淀，重新悬浮后以9000 g再离心20 min，弃上清得线粒体.全部操作于4 ℃进行.2、培养细胞提取线粒体.细胞弃去培养液后，用细胞收集液作用2到3 min，用scraper,将细胞收集起来，6000 g离心15 min。弃上清，之后加细胞匀浆液，用匀浆器或手动匀浆管匀浆，将装有匀浆液的离心管配平后放入普通离心机，以2500 rpm，离心15 min,缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中.以17000 rpm离心20 min，弃上清，留取沉淀物。加入0．25mol/L蔗糖与0．003 mol/L氯化钙液l ml，用吸管吹打成悬液，以17000 rpm离心20 min，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol/L蔗糖与0.003mol/L氯化钙溶液混匀成悬液.即得线粒体。简单的鉴定人线粒体的方法:1、形态法辨别取你用试剂盒提取最后一步的上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上,标记涂片，各滴一滴0.02％詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。油镜 下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。2、PCR法抽提你提取的线粒体DNA。人线粒体基因由16569个碱基对组成。基因组含有37个基因，其中13个为蛋白质基因。2个为rRNA基因，还有22 个tNRA基因。可以选择扩增其中编码电子传递链酶复合体中的亚基基因进行辨别。3、利用单抗进行标记检测线粒体外膜的标记酶为单胺氧化酶,用单胺氧化酶单克隆抗体进行反应后上流式细胞仪进行检测。4、电镜下观察（有条件的话上电镜进行观察恐怕是最直接的了）我个人认为如果你的课题必须鉴定线粒体的完整性,或必须使用较完整的线粒体,那么最好还是上电镜,因为其他方法都是间接证明你的提取物是线粒体。最后液闪仪我没有用过,不过我觉得提取的线粒体数目应该足够你做(每个心肌细胞中都有1000个的线粒体).具体的上样标准我觉得需要查你 使用的液闪仪的说明书.