Question

逆转录时总RNA的量对cDNA、PCR结果有没有影响

请教各位高手：在提取RNA后测了RNA浓度，但各个标本浓度不一样，比如有A 2ug/ul,有B 3ug/ul,请问逆转录时总RNA的量是不是说必须要一样，比如A加1.5ul,B加1ul，即均为3ug。还是都加一样的体积比如1ul，哪种加法是对的？逆转录时总RNA的量对cDNA、PCR结果有没有影响？谢谢！！！

Answer 1

博凌科为-为你解答：逆转录时总RNA的量对cDNA、PCR结果看你是准备用cDNA来做什么用。一般来说，如果后面做绝对定量，有影响，如果只是PCR，除了同样循环次数条带亮度不同，可能没有其他影响。

Answer 2

如果提取RNA是为了测定基因的相对表达量，那么逆转录时各样本间总RNA的量要保持一致，就像你说的A加1.5，B加1，使得总量为3ug。这样才能保证在之后RT-PCR比较基因表达量时，各个样本都站在同一起跑线上。

Answer 3

pcr，尤其是普通pcr，对模板的质量要求并不高。
你自己提取rna反转录的话，得到大量的cdna(这里还有一个问题，你用哪种引物做反转录)
买来的cdna如果是针对你的基因的话，可能做过一定的纯化，
如果你图方便的话，肯定是买的就ok
自己反转录的话效率也很高，cdna可以稀释10倍，100倍去做pcr都能扩增
具体问题具体讨论。