Question

DNA手动测序 双脱氧末端终止法

DNA手动测序中有一种叫做双脱氧末端终止法的方法。其中有一步是待模板与引物退火后，加入DNA聚合酶和4种dNTP,其中一种用放射性同位素标记。。。为什么只标一种，每管标了2种会怎么样呢？

Answer 1

双脱氧末端终止法，是在反应体系中加入单链的模板、引物、四种dNTP和DNApol，再将其分为四组，每组加入一种用放射性同位素标记的ddNTP，在PCR时，这种ddNTP能随机插入合成的子代链中，在掺入的位置，DNA合成终止，这样就可以得到一系列的在四种ddNTP处合成中断的段链，电泳后，通过放射自显影技术就可以读出样品的DNA序列。如果加入两种放射性同位素标记的ddNTP，原理是一样的。

追问

那是后面那一步了。。。我是想问 在PCR之前加模板、引物、四种dNTP和DNApol时，dNTP要放射同位素标记 然后好像也没说ddNTP要放射标记啊。。。

追答

dNTP放射性标记是为了放射自显影

追问

那为什么每管只标一种，每管标了2种会怎么样呢？

Answer 2

4个反应池只能各标记其中之一，否则在电泳是无法区分发光的是何种碱基。高分辨凝胶电泳是可以区分只相差一个碱基的DNA 片段的。

追问

恩恩。可以接受的解释啊。可以顺便再问2个问题吗？（1）基因打靶是不是就是原位杂交？（2）基因敲除和基因打靶是什么关系？

追答

不是，原位杂交是指把标记好了的DNA探针注入细胞内，让它和细胞内的同源系列发生重组达到测序的目的。而基因打靶是定向的把细胞内的某一序列敲出或者敲入，基因打靶包基因敲出和基因敲入。满意后给分啊，老大.....

Answer 3

标记是为了能够检测到那种你标记的dntp，如果同时加两种的话，后面测序的时候会出现发出的荧光信号会是两种颜色的混合体，你就分不清那个位置到底是哪种碱基