Question

PCR的问题

pcr结果得不到想要的片段，我是使用四个片段合成一个，结果产物全部都小，再用产物做pcr得到的片段是其中最小的一条。请问我要用什么方法能得到想要的片段？3号片段自己有一个19bp重复，其余重复不超过12bp，1号片段高GC，发夹结构不超过12bp，且没有很强的键能。之前试过降低退火温度，但是没用。哪位大侠知道该怎么解决一下？

Answer 1

1、PCR产物的电泳检测时间：一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。
2、假阴性，不出现扩增条带
模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。
对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
3、假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
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4、出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
5、出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。
参考资料来源：/baike.baidu.com/item/PCR%E6%89%A9%E5%A2%9E/9414061#8"target="_blank"title="百度百科-PCR扩增">百度百科-PCR扩增

Answer 2

你可以做一个梯度PCR，用高保真酶。如果还是没有扩出来的，那可能就是你的药品问题了，buffer啊，dNTP啊，酶啊有问题、
多试几次，相信会成功的

另外有些步骤你参考下，看是不是控制条件上有点问题
1.反应体系与反应条件
　　标准的PCR反应体系：
　　10×扩增缓冲液10ul
　　4种dNTP混合物各200umol/L
　　引物各10～100pmol
　　模板DNA0.1～2ug
　　TaqDNA聚合酶2.5u
　　Mg2+1.5mmol/L
　　加双或三蒸水至100ul
　　PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)

2.工作步骤
　　

PCR反应的基本过程
标准的PCR过程分为三步（：
　　1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，
　　氢键断裂，形成单链DNA
　　2.退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低，引物与
　　DNA模板结合，形成局部双链。
　　3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活
　　性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延
　　伸，合成与模板互补的DNA链。
　　每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。
　　现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

追问

我用的就是高保真的KOD酶，其实高保真酶不是有非特异条带的概率更大吗。反应条件没问题。
你说的touthdown倒是考虑了，但是这个产量会小吧。
有没有更好的方法啊？

追答

暂时也没有想到更好的办法，我也在学习这个，多试验几次试试吧，有时一些经验的获得也要很多次实验的，你在做的过程中也许就会发现更好的方法