Question

近期在质粒构建是PCR和酶切后都有目的条带，但是就是连接转化后没有点，或者有点但是是阴性的，哪有问题

感受态不行？
目的片段没有酶切成功？
没有连接上？
载体不行？

Answer 1

都有可能
你可以多做几个对照,如空载体转化、空细胞涂板等等，帮助缩问题小范围
你可以询问实验室其他人员，看看酶是否有问题，感受态是否有问题，抗生素是否有问题，等等
按你给的线索，菌落很少，很有可能是切开的线性质粒没有连上片段，转不进细胞，少量没有切开的空载体转进细胞，形成阴性菌落。问题可能在片段酶切上，建议连T载体再切，或双酶切换成两步单酶切，或换酶切位点，或重新设计保护碱基

Answer 2

以前遇到过类似问题，当时主要问题是酶切用的内切酶不太好了。后来我们改进了方法，先把PCR产物连到T simple载体上（这很容易），测序无误后再将它们从T载体上切下来，这样可以保证你看到的条带全部是已经切好的。然后进行连接。

Answer 3

连T载体拿去测序 看P出来的是不是你要的条带 要么就是质粒酶切的之后回收的不好 最好在旁边跑一道没有切的质粒 这样能看出来哪条带是切开的质粒