Question

农杆菌转化实验步骤

Answer 1

农杆菌转化法的实验步骤

       整个转基因体系的建立步骤大致可以归纳为：基因表达载体的构建－载体的农杆菌转化－农杆菌与植株共培养－转化植株的筛选－转化植株的鉴定。在每一步中都涉及到很多的方法与技术。

1．获取目的基因：用限制性核酸内切酶分别切割下目的基因（如抗虫基因）和Ti质粒。可以采用肆戚核双酶切，防止自身环化和目的基因单向插入Ti质粒。

2．基因表达载体的构建：将目的基因与载体（Ti质粒）用DNA连接酶连接起来。

3．将重组DNA分子导入农杆菌：将含目的基因的重组质粒导入农杆菌, 此农杆菌和提供Ti质粒的农杆菌应该不同。 

4．植株转化实验：农杆菌与植物细胞的共培养，在溶液中加入促进植株愈伤生长的激素能一定程度提高转化率。转化细胞的筛选，大多是利用抗生素进行筛选的，抗生素的选择则需根据目的载体确定。同时进行仔搏利用抗生素完成脱菌的过程。也有的资料提供的是感染植株，也就是农杆菌直接去感染植物。

5．最后将成功表达的细胞通过脱分化和再分化形成植株或直接感染的植物体，对植物体进行个裂掘体生物学水平鉴定。