Question

6，dna点突变常用的检测方法有哪些

Answer 1

基因突变检测方法：
（1）
pcr-sscp法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链dna和rna分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链dna在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。
（2）异源双链分析法（ha）
ha法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型dna双链。由于突变和野生型dna形成的异源杂合双链dna在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双dna不同的迁移率。该法与sscp相似，所不同的是sscp分离的是单链dna，ha法分离的是双链dna，也只适合于小片段的分析。
（3）突变体富集pcr法（mutant-enriched
pcr）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如k-ras基因第12密码子的bstni位点，第13密古巴子有bgⅰⅱ位点。用链续二次的巢式pcr来扩增包括k-ras第12、13密码子的dna片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的dna片段，野生型因被酶切而不能进入第二次pcr扩增，而突变型则能完整进入第二次pcr扩增并得到产物的富集。

Answer 2

1．限制性片段长度多态性（Restriction
Fragment
Length
Polymorphism,RFLP）：由DNA
的多态性,致使DNA
分子的限制酶切位点及数目发生改变,用限制酶切割基因组时,所产生的片段数目和每个片段的长度就不同,即所谓的限制性片段长度多态性,导致限制片段长度发生改变的酶切位点,又称为多态性位点.最早是用Southern
Blot/RFLP方法检测,后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法.现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性.\x0d2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法.相同长度的单链DNA如果顺序不同,甚至单个碱基不同,就会形成不同的构象.在电泳时泳动的速度不同.将PCR产物经变性后,进行单链DNA凝胶电泳时,靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时,就会出现泳动变位（mobility
shift）,多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变.