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一、菌落总数
Aerobic Bacterial Count
1 范围
本规范规定了菌落总数的检验方法。
2 定义
本规范采用下列定义
菌落总数(aerobic bacterial count)是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培养基成分、培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等)，1g(1mL)检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。
测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进行卫生学总评价的综合依据。
3 仪器和设备
3.1 三角瓶。
3.2 量筒。
3.3 pH计或精密pH试纸。
3.4 高压灭茵器。
3.5 试管。
3.6 平皿： 直径9cm。
3.7 刻度吸管： 10mL、2mL、1mL。
3.8 酒精灯。
3.9 恒温培养箱。
3.10 放大镜。
4 培养基和试剂
4.1 生理盐水：成分：氯化钠 8.5g
蒸馏水加至 1000 mL
溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶90mL，103.43kPa(15 lb)20min高压灭菌。
4.2 卵磷脂、吐温80—营养琼脂培养基
4.2.1 成分： 蛋白胨 20g
牛肉膏 3g
氯化钠 5g
琼脂 15g
卵磷脂 1g
吐温80 7g
蒸馏水 1000mL
4.2.2 制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80，将其他成分(除琼脂外)加到其余的蒸馏水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，调pH值为 7.1～7.4，加入琼脂，103.43kPa(15 lb)20min高压灭菌，储存于冷暗处备用。
4.3 0.5%氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyl terazolium chloride,TTC)
成分： TTC 0.5g
蒸馏水 100mL
溶解后过滤，103.43kPa(15 lb)20min高压灭菌，装于棕色试剂瓶，置4℃冰箱备用。
5 操作步骤
5.1 用灭菌吸管吸取1:10稀释的检液2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面)，更换一支吸管，并充分混匀，制成1:100检液。吸取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。如样品含菌量高，还可再稀释成1:1000，1:10000，……等，每种稀释度应换1支吸管。
5.2 将融化并冷至45℃～50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48h。另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约15mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48h，为空白对照。
5.3 为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每100mL卵磷脂吐温80营养琼脂中加入1mL0.5%的TTC溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。
6 菌落计数方法
先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5～10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。
7 菌落计数及报告方法
7.1 首先选取平均菌落数在30～300个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数(见表1中例1)。
7.2 若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数(见表1中例2及例3)。
7.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例4)。
7.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1例5)。
7.5 若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例6)。
7.6 若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每g或每mL小于10CFU。
7.7 菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示(见表1报告方式栏)。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。
表1 菌落计数结果及报告方式
例 次 不同稀释度平均菌落数
10-1 10-2 10-3 两稀释度
菌数之比 菌落总数
CFU/mL或 CFU/g 报告方式
CFU/mL或 CFU/g
1 1365 164 20 ─ 16400 16000 或 1.6×104
2 2760 295 46 1.6 38000 38000或3.8×104
3 2890 271 60 2.2 27100 27000 或 2.7×104
4 不可计 4650 513 ─ 513000 510000 或 5.1×105
5 27 11 5 ─ 270 270或 2.7×102
6 不可计 305 12 ─ 30500 31000 或 3.1×104
7 0 0 0 ─ ＜1×10 ＜10
＊CFU：菌落形成单位。
二、粪大肠菌群
Fecal Coliforms
1 范围
本规范规定了粪大肠菌群的检验方法。
2 定义
本规范采用下列定义
粪大肠菌群(Fecal coliforms)系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5℃培养24h～48h能发酵乳糖产酸并产气。
该菌来自人和温血动物粪便，是重要的卫生指示菌。
3 仪器
3.1 恒温水浴箱或隔水式恒温箱：44℃±0.5℃。
3.2 温度计。
3.3 显微镜。
3.4 载玻片。
3.5 接种环。
3.6 电炉。
3.7 三角瓶。
3.8 试管。
3.9 小倒管。
3.10 pH计或pH试纸。
3.11 高压灭茵器。
3.12 刻度吸管：10mL、2mL、1mL。
3.13 平皿。
4 培养基和试剂
4.1 双倍乳糖胆盐培养基
成分： 蛋白胨 40g
猪胆盐 10g
乳糖 10g
0.4%溴甲酚紫水溶液 5mL
蒸馏水 1000mL
制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，调pH到7.4，加入0.4%溴甲酚紫水溶液5mL，混匀，分装试管(每支试管中加一个小倒管)。68.95kPa (10 lb)20min灭菌。
4.2 伊红美兰(EMB)琼脂
成分： 蛋白胨 10g
乳糖 10g
磷酸氢二钾 2g
琼脂 20g
2%伊红水溶液 20mL
0.5%美蓝水溶液 13mL
蒸馏水 1000mL
制法：先将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾、蛋白胨，混匀，使之溶解。再以蒸馏水补足至1000mL。校正pH值为7.2～7.4，分装于三角瓶内，103.43kPa(15 lb)15min高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至60℃左右无菌操作加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。倾注平皿备用。
4.3 蛋白胨水(作靛基质试验用)
成分： 蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g
氯化钠 5g
蒸馏水 1000mL
制法：将上述成分加热融化，调pH值为7.0～7.2，分装小试管，103.43kPa(15 lb)15min高压灭菌。
4.4 靛基质试剂
柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL。
试验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于44±0.5℃培养24h。 沿管壁加柯凡克试剂0.3～0.5mL，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。
注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。
4.5 革兰氏染色液：
4.5.1 染液制备
4.5.1.1 结晶紫染色液：
结晶紫 1g
95%乙醇 20mL
1%草酸铵水溶液 80mL
将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
4.5.1.2 革兰氏碘液：
碘 1g
碘化钾 2g
蒸馏水加至 300mL
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。
4.5.1.3 脱色液：95%乙醇。
4.5.1.4 复染液：
a. 沙黄复染液：
沙黄 0.25g
95%乙醇 10mL
蒸馏水 90mL
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
b. 稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95%乙醇100mL，放置过夜，滤纸过滤。取该液10mL，加5%石碳酸水溶液90mL混合，即为石碳酸复红液。再取此液10mL加水90mL，即为稀石碳酸复红液。
4.5.2 染色法
4.5.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。
4.5.2.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
4.5.2.3 滴加95%乙醇脱色，约30s，或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s，水洗。
4.5.2.4 滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。
4.5.3 染色结果
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
注：如用1:10稀释石碳酸复红染色液作复染，复染时间仅需10s。
5 操作步骤
5.1 取10mL 1:10稀释的检液，加到10mL双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置44℃±0.5℃培养箱中培养24h～48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。
5.2 如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置37℃培养18 h～24 h。同时取该培养液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44℃±0.5℃培养24h。
经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选。
5.3 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。
5.4 在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。
6 检验结果报告
根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。
仅提供建议参考。
Aerobic Bacterial Count
1 范围
本规范规定了菌落总数的检验方法。
2 定义
本规范采用下列定义
菌落总数(aerobic bacterial count)是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培养基成分、培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等)，1g(1mL)检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。
测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进行卫生学总评价的综合依据。
3 仪器和设备
3.1 三角瓶。
3.2 量筒。
3.3 pH计或精密pH试纸。
3.4 高压灭茵器。
3.5 试管。
3.6 平皿： 直径9cm。
3.7 刻度吸管： 10mL、2mL、1mL。
3.8 酒精灯。
3.9 恒温培养箱。
3.10 放大镜。
4 培养基和试剂
4.1 生理盐水：成分：氯化钠 8.5g
蒸馏水加至 1000 mL
溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶90mL，103.43kPa(15 lb)20min高压灭菌。
4.2 卵磷脂、吐温80—营养琼脂培养基
4.2.1 成分： 蛋白胨 20g
牛肉膏 3g
氯化钠 5g
琼脂 15g
卵磷脂 1g
吐温80 7g
蒸馏水 1000mL
4.2.2 制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80，将其他成分(除琼脂外)加到其余的蒸馏水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，调pH值为 7.1～7.4，加入琼脂，103.43kPa(15 lb)20min高压灭菌，储存于冷暗处备用。
4.3 0.5%氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyl terazolium chloride,TTC)
成分： TTC 0.5g
蒸馏水 100mL
溶解后过滤，103.43kPa(15 lb)20min高压灭菌，装于棕色试剂瓶，置4℃冰箱备用。
5 操作步骤
5.1 用灭菌吸管吸取1:10稀释的检液2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面)，更换一支吸管，并充分混匀，制成1:100检液。吸取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。如样品含菌量高，还可再稀释成1:1000，1:10000，……等，每种稀释度应换1支吸管。
5.2 将融化并冷至45℃～50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48h。另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约15mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48h，为空白对照。
5.3 为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每100mL卵磷脂吐温80营养琼脂中加入1mL0.5%的TTC溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。
6 菌落计数方法
先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5～10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。
7 菌落计数及报告方法
7.1 首先选取平均菌落数在30～300个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数(见表1中例1)。
7.2 若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数(见表1中例2及例3)。
7.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例4)。
7.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1例5)。
7.5 若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例6)。
7.6 若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每g或每mL小于10CFU。
7.7 菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示(见表1报告方式栏)。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。
表1 菌落计数结果及报告方式
例 次 不同稀释度平均菌落数
10-1 10-2 10-3 两稀释度
菌数之比 菌落总数
CFU/mL或 CFU/g 报告方式
CFU/mL或 CFU/g
1 1365 164 20 ─ 16400 16000 或 1.6×104
2 2760 295 46 1.6 38000 38000或3.8×104
3 2890 271 60 2.2 27100 27000 或 2.7×104
4 不可计 4650 513 ─ 513000 510000 或 5.1×105
5 27 11 5 ─ 270 270或 2.7×102
6 不可计 305 12 ─ 30500 31000 或 3.1×104
7 0 0 0 ─ ＜1×10 ＜10
＊CFU：菌落形成单位。
二、粪大肠菌群
Fecal Coliforms
1 范围
本规范规定了粪大肠菌群的检验方法。
2 定义
本规范采用下列定义
粪大肠菌群(Fecal coliforms)系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5℃培养24h～48h能发酵乳糖产酸并产气。
该菌来自人和温血动物粪便，是重要的卫生指示菌。
3 仪器
3.1 恒温水浴箱或隔水式恒温箱：44℃±0.5℃。
3.2 温度计。
3.3 显微镜。
3.4 载玻片。
3.5 接种环。
3.6 电炉。
3.7 三角瓶。
3.8 试管。
3.9 小倒管。
3.10 pH计或pH试纸。
3.11 高压灭茵器。
3.12 刻度吸管：10mL、2mL、1mL。
3.13 平皿。
4 培养基和试剂
4.1 双倍乳糖胆盐培养基
成分： 蛋白胨 40g
猪胆盐 10g
乳糖 10g
0.4%溴甲酚紫水溶液 5mL
蒸馏水 1000mL
制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，调pH到7.4，加入0.4%溴甲酚紫水溶液5mL，混匀，分装试管(每支试管中加一个小倒管)。68.95kPa (10 lb)20min灭菌。
4.2 伊红美兰(EMB)琼脂
成分： 蛋白胨 10g
乳糖 10g
磷酸氢二钾 2g
琼脂 20g
2%伊红水溶液 20mL
0.5%美蓝水溶液 13mL
蒸馏水 1000mL
制法：先将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾、蛋白胨，混匀，使之溶解。再以蒸馏水补足至1000mL。校正pH值为7.2～7.4，分装于三角瓶内，103.43kPa(15 lb)15min高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至60℃左右无菌操作加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。倾注平皿备用。
4.3 蛋白胨水(作靛基质试验用)
成分： 蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g
氯化钠 5g
蒸馏水 1000mL
制法：将上述成分加热融化，调pH值为7.0～7.2，分装小试管，103.43kPa(15 lb)15min高压灭菌。
4.4 靛基质试剂
柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL。
试验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于44±0.5℃培养24h。 沿管壁加柯凡克试剂0.3～0.5mL，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。
注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。
4.5 革兰氏染色液：
4.5.1 染液制备
4.5.1.1 结晶紫染色液：
结晶紫 1g
95%乙醇 20mL
1%草酸铵水溶液 80mL
将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
4.5.1.2 革兰氏碘液：
碘 1g
碘化钾 2g
蒸馏水加至 300mL
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。
4.5.1.3 脱色液：95%乙醇。
4.5.1.4 复染液：
a. 沙黄复染液：
沙黄 0.25g
95%乙醇 10mL
蒸馏水 90mL
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
b. 稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95%乙醇100mL，放置过夜，滤纸过滤。取该液10mL，加5%石碳酸水溶液90mL混合，即为石碳酸复红液。再取此液10mL加水90mL，即为稀石碳酸复红液。
4.5.2 染色法
4.5.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。
4.5.2.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
4.5.2.3 滴加95%乙醇脱色，约30s，或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s，水洗。
4.5.2.4 滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。
4.5.3 染色结果
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
注：如用1:10稀释石碳酸复红染色液作复染，复染时间仅需10s。
5 操作步骤
5.1 取10mL 1:10稀释的检液，加到10mL双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置44℃±0.5℃培养箱中培养24h～48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。
5.2 如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置37℃培养18 h～24 h。同时取该培养液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44℃±0.5℃培养24h。
经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选。
5.3 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。
5.4 在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。
6 检验结果报告
根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。
仅提供建议参考。
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