Question

高通量测序技术及原理介绍

Answer 1

什么是高通量测序

高通量测序技术也被称作二代测序技术（Next Generation Sequencing, NGS），这是相对一代测序技术（Sanger Sequencing）而言的，同时由于高通量测序的出现使得我们能对一个物种的基因组和转录组进行全面、细致的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。高通量测序技术以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志，通过读取多个短DNA 片段，拼接成完整的序列信息。与一代测序Sanger法相比，高通量测序技术在处理大规模样品时具有显著的优势，在测序速度及测序通量上具有无可取代的地位，是目前组学研究中的核心技术。 

测序原理：将基因组 DNA 片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒 DNA。每个每个循环测序反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，并产生荧光标记，最终得到一组长几百至几千碱基的链终止产物，它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上。通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。