Question

质粒提取的主要步骤是什么及其作用 分子生物学

Answer 1

如今提取质粒主要用的还是碱裂解法提取。
http://www.360doc.com/content/14/1207/19/20843655_431108233.shtml
原理可以进上面的链接看。

操作步骤： 本实验方法适用于从 1-10ml 过夜培养的大肠杆菌菌液中提取质 粒。提取量受菌株、质粒拷贝数、菌液体积和培养时间、培养基类型 等因素的综合影响

1. 收菌：将过夜培养（37℃，12-16 小时）的菌液于室温≧10,000g 离心 1-2 分钟，彻底弃除上清。注意：高拷贝质粒建议使用≦5ml 菌液；菌液用量过大不仅不能增加质粒产 量， 反而会因裂解不完全或杂质封闭硅胶膜而降低产量；培养时间不宜过长， 否则会增加开环结构质粒的比例。

2. 重悬：加入 250µl 含 RNase A 的细胞悬浮液（S1） ，充分混悬震荡 或用枪头反复抽打使细菌彻底分散悬浮

3. 裂解：加入 250µl 细胞裂解液（S2） ，轻轻上下颠倒混合 5 次，室 温静置 1-5 分钟，待细菌充分裂解，溶液变半透明。

注意：避免剧烈震荡导致基因组 DNA 裂解，裂解时间不能超过 5 分钟。

4. 中和：加入 350µl 中和缓冲液（S3） ，轻轻上下颠倒混合 5 次，充 分混匀，避免剧烈震荡。室温下≧12,000g 离心 10 分钟。

5. DNA 结合：小心吸取上清，转移到插入收集管的离心吸附柱内，室 温下≧12,000g 离心 1 分钟，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱 重新插回收集管中。

6. 清洗：加入 500µl 漂洗液 （WB,请确认已加入乙醇！ ）于离心吸附 柱中，室温下≧12,000g 离心 30 秒，弃除收集管中的废液，将离 心吸附柱重新插回收集管中。

7. 再次清洗：加入 500µl 漂洗液 （WB）于离心吸附柱中，室温下≧ 12,000g 离心 30 秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。将离心吸附柱开盖再次离心 2 分钟，彻底除去残余 漂洗液。

8. 洗脱：小心取出离心吸附柱，将其套入一个新的 1.5ml 灭菌离心 管中。向硅胶吸附膜的中央加入 100µl 洗脱缓冲液（EB） ，室温放 置 1 分钟后，≧12,000g 离心 1 分钟收集质粒 DNA。

注意：为提高质粒浓度，最低可使用 30µl 的 EB 溶液，离心收集后壳将洗脱 的质粒溶液再次加入离心吸附柱中重复洗脱；使用 100µlEB 溶液则无需二次 洗脱；对 6kb 以上的质粒，可使用预先加热至 55℃的 EB 溶液洗脱以提高产 量；EB 溶液不含 EDTA，故不会影响荧光测序等后续反应；如必须使用无菌去 离子水洗脱， 需注意其 pH 值是否接近中性，否则应使用 NaOH 溶液将 pH 值调 节至 7.0-8.5 之间。

9. 储存：弃除离心吸附柱，纯化的质粒可直接用于后续反应或于 -20℃长期保存。

注意：经检测，本试剂盒从 endA¯菌株（如 DH5α ，TOP10，XL1-blue 等）中 提取的质粒反复冻融 20 次无降解；如需在 4℃长期保存或者保存从 endA+菌 株（如 JM109，HB101，BL21 等）中提取的质粒，可向每 100µl 质粒溶液中加 入 11µl 的 10×TE

若有，望采纳！！！