Question

各位高手，我的PCR条带弥散，阴性对照也弥散，但是不加引物不弥散，当然也没有条带，请问都是什么原因啊？

非常谢谢你的帮助！

Answer 1

阴性对照的作用就是来判断实验是否有污染的，如果PCR条带和阴性对照都弥散的话，原因应该是污染。污染一般有试剂的污染，也有可能是环境的污染。
先说试剂的污染。你设置的阴性对照所用的每一种试剂都存在被污染的可能，最实际也最麻烦的方法就是，每次更换一种试剂，重复实验，从而确定那种试剂发生污染。你提到的不加引物不弥散，那是必然的结果，及时所有试剂都发生了污染，不加入引物，扩增也是没办法进行的，结果也不会有条带。
再说环境的污染。环境的污染一般就是指气溶胶的污染，PCR实验室多少都会存在这种问题，气溶胶是比较难以消除的。先假设你所用的试剂都是正常的，你可以选择两到三对PCR产物片段较长的引物做试验（比你此次出问题的实验所选的要长），进行正常PCR，电泳看结果是如何，如果不出现弥散现象，可初步判断为气溶胶污染。接着选两到三对产物片段较短的做实验（同上），观察结果，如果同样出现弥散现象，此时可断定确实是气溶胶污染。
以上所说，属于理想状态，首先要排除个人操作失误，另外具体的情况再具体分析！
个人理解，希望对你有帮助！

追问

我用同样的试剂换一对引物PCR，有清晰的条带，证明试剂没有问题。考虑你说的气溶胶污染，我换个地方再加样一次试试。有了结果再向你请教啊。非常感谢了。

Answer 2

降低电压 跑慢点

Answer 3

是跑出的条带很糊么？如果是的话，按照你说的阴性对照也弥散应该是引物的问题，也有可能是PCR试剂的问题，还有可能是退火温度的问题。逐个排除吧。

Answer 4

引物有无污染，跑个电泳看看