Question

PCR产物测序问题。

我用简并引物扩增未知基因。设计了几对引物。都出现了目的条带。发现其中两对引物的产物长度比较长。因为我最终是要拿到这个未知基因的全长。我想选择最长的目的条带去测序。最后用RACE扩增全长的时候就能省点力气。这样对吗？还有，可不可以直接胶回收纯化送去测序？省掉TA克隆。我的目的片段长度1300BP.谢谢解惑。没分了。谢谢帮忙。

Answer 1

PCR 产物测序的最大风险是有在正衡燃凝胶上看起来的一个条带，实际上有多个分子。也就是说长度相似的分子有可能在电泳的时候只有一条带。如果只是进行PCR产物回收，没有进行凝胶分离的过程的话，东西可能更多了。问题就在于，如果出现双峰或者多峰，这个样品就白送了，什么也结果也没有。
特别你现在用的还是简并引物，本身目标就是为了能扩增出目标片段来，比较建议先做TA克隆，然后测序的时候，最好挑几个克隆去测，不要只送一个克隆。现在测序也不贵，这样一次测上几个克隆，也可以确认在扩增出来的片段中，是否只有一个分子，还是其实有多个不同序列的片段。
另外，长度选择的问题，既然举虚设计了简并引物，就是要钓取目前序列还未知的基因，可以选择从长片段开始测序，根据这个结果再考虑短的片段是否需要再继续测序。只有拦耐拿到目标序列了，才能决定下一步采用什么方式来获得全长的基因片段。

Answer 2

PCR产物也可以直接拿过去测余颂序，如果你的PCR产物只有一条扒毁枯带的话（可要确定哦），当然只是价格稍贵。因为公司拿过去也要克隆转化后才能测序，其实TA克隆已经很容易春洞的啦！