在整个酶切反应过程中应注意哪些问题?

 我来答
GM的好客户
2012-10-23 · TA获得超过3653个赞
知道小有建树答主
回答量:492
采纳率:66%
帮助的人:160万
展开全部
1) 成功酶切的关键是准备好模板DNA。DNA样品中不能含有有机溶剂(会使酶变性或产生星号 货性),不能含有干扰酶活性的污染物质,不能含有高浓度的EDTA (TE中的EDTA浓度较低,对Mg的浓度影响较小);同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。
2) 选用合适的酶。根据酶切序列选用,特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。
3) 正确使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低温环境中,只是在需要用酶才从冰箱中取出来。 运输和临时存放时需要将酶至于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分,移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。用完后需要及时送回原处。注意:酶通常是最后加。所有
4) 反应体积需要根据实验目的定,常规的酶切一般要维持在10-50ul,酶切鉴定 10-20ul就可以了。
5) 模板浓度问题:浓度过高,溶液黏度过大,酶不能有效扩散,酶切效果不会好。浓度过低,也会 影响酶活性。
6) 注意模板用量和反应体积的关系。对酶用量,模板用量,反应体积等要素的确定需要的是时间和 经验的积累。
7) 酶切反应的各个组分加完后,需要用TIP小心混匀几次,short spin 一下就可以保温了。一般不能使用振荡器混匀。
8) 反应温度的选择。一般反应都用37度,但是 Sma I 的最适合温度是25度,37度时酶仍表现出活性,但是效率下降50%。部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应,如Taq I的最适温度为65度,37度保温,效率仅为前者的1/10。
9) 反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了。要完全酶切可以采用少量的酶长时间反应, 或较高的酶量短时间处理都可以达到。在使用高酶量的时候需要注意甘油的最终浓度不要超过5%,也就是说10ul的体系,酶的用量不要超过1ul。
10) 是否和如何终止反应?酶切鉴定之类的实验不需要特殊处理。灭活的手段:加入高浓度的 EDTA;65度或80度热处理20-30分钟;部分从高温菌纯化出来的内切酶由于最适的反应温度比较高,热处 理灭活不一定完全,需要用苯酚/氯仿/乙醇方法纯化;电泳回收也是实验室常用除酶的手段。
本回答被网友采纳
已赞过 已踩过<
你对这个回答的评价是?
评论 收起
收起 1条折叠回答
推荐律师服务: 若未解决您的问题,请您详细描述您的问题,通过百度律临进行免费专业咨询

为你推荐:

下载百度知道APP,抢鲜体验
使用百度知道APP,立即抢鲜体验。你的手机镜头里或许有别人想知道的答案。
扫描二维码下载
×

类别

我们会通过消息、邮箱等方式尽快将举报结果通知您。

说明

0/200

提交
取消

辅 助

模 式