Question

在整个酶切反应过程中应注意哪些问题?

Answer 1

1) 成功酶切的关键是准备好模板DNA。DNA样品中不能含有有机溶剂（会使酶变性或产生星号 货性），不能含有干扰酶活性的污染物质，不能含有高浓度的EDTA (TE中的EDTA浓度较低，对Mg的浓度影响较小)；同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。
2) 选用合适的酶。根据酶切序列选用，特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。
3) 正确使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低温环境中，只是在需要用酶才从冰箱中取出来。 运输和临时存放时需要将酶至于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分，移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。用完后需要及时送回原处。注意：酶通常是最后加。所有
4) 反应体积需要根据实验目的定，常规的酶切一般要维持在10-50ul，酶切鉴定 10-20ul就可以了。
5) 模板浓度问题：浓度过高，溶液黏度过大，酶不能有效扩散，酶切效果不会好。浓度过低，也会 影响酶活性。
6)　注意模板用量和反应体积的关系。对酶用量，模板用量，反应体积等要素的确定需要的是时间和 经验的积累。
7) 酶切反应的各个组分加完后，需要用TIP小心混匀几次，short spin 一下就可以保温了。一般不能使用振荡器混匀。
8) 反应温度的选择。一般反应都用37度，但是 Sma I 的最适合温度是25度，37度时酶仍表现出活性，但是效率下降50%。部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应，如Taq I的最适温度为65度，37度保温，效率仅为前者的1/10。
9) 反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了。要完全酶切可以采用少量的酶长时间反应， 或较高的酶量短时间处理都可以达到。在使用高酶量的时候需要注意甘油的最终浓度不要超过5%，也就是说10ul的体系，酶的用量不要超过1ul。
10) 是否和如何终止反应？酶切鉴定之类的实验不需要特殊处理。灭活的手段：加入高浓度的 EDTA；65度或80度热处理20-30分钟；部分从高温菌纯化出来的内切酶由于最适的反应温度比较高，热处 理灭活不一定完全，需要用苯酚/氯仿/乙醇方法纯化；电泳回收也是实验室常用除酶的手段。