Question

引物 基因 构建克隆载体与表达载体 重组子的筛选 诱导表达以及如何检测和纯化表达产物

假定你要克隆和表达神经生长因子(EGF)，用于研究该因子对神经细胞的保护作用。请设计一个实验方案，简要阐明如何设计引物？如何获得基因？如何选用和构建克隆载体与表达载体？如何进行重组子的筛选？如何进行诱导表达以及如何检测和纯化表达产物？ 跪谢啊 ~回答的细一点， 再给加分啊~~
克隆和表达神经生长因子(EGF)

Answer 1

1、一般是通过设计软件，例如oligo6，primer5等，你可以在网上搜一下引物设计软件下载和使用说明，是比较容易的。我一般用DANMAN设计引物，这个软件操作简单，占用资源也小。
至于设计引物的一般原则如下：
* 序列选取应在基因的保守区段
* 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构
* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
* Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
* 引物之间的TM相差避免超过2℃
* 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基
* 为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
* Taqman探针PCR要求片段长度在80bp－150bp
* 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
2、设计引物的时候你也顺带设计了酶切，那么就可以通过PCR扩增你的目的基因，然后通过双酶切获得大量目的基因。
后续试验要根据你需要此基因做什么研究来看了，不同研究选用不同的表达载体，不同实验需求是不同的，这个建议你跟你们实验室的其他人商量或者询问老师，希望这些能帮到你！

Answer 2

注意，神经生长因子的缩写是NGF（nerve growth factor），EGF是表皮生长因子的缩写。
第一，在NCBI上找nerve growth factor的基因序列，结果如下
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?term=nerve%20growth%20factor

然后看你需要找什么物种的，比如人就是 Homo sapiens，小鼠就是Mus musculus，这里都是用拉丁名的。
第二，下载一个Primer Premier 5，个人感觉这个比较好用。设计引物就根据你找到的序列进行设计，这个网上很多，到处都能找到，比如生物秀啊，丁香园什么的都有。
第三，克隆载体的话，主要看你是真核表达还是原核表达了，如果是真核表达的话，你用来研究对神经细胞的保护就应该要转染到神经细胞中表达的载体，我只做过癌细胞表达的载体，当时用的是pcDNA3.1，为了方便筛选的话，你还可以选用上面含有GFP基因的载体。如果是原核表达的话，pET系列的很多载体都可以了。
第四，筛选一般是用抗生素进行的，真核筛选就加在培养基里面筛选，主要用新霉素什么的，原核一般都是涂板筛选，抗生素用氨苄青霉素和卡纳霉素较多。
第五，真核不用诱导；原核的话，一般是大多数是用IPTG，如果是一些特殊的载体，上面是什么操纵子，上面应该有写清楚的。
第六，真核，原核一般都可以用SDS-PAGE检测。
第七，纯化的话方法很多，过不同的柱。原核的话载体上面有很多比如his标签什么的，真核有的载体有flag标签，不过如果没有标签可以用亲和，离子交换，甚至高效液相色谱也是可以用来纯化的。

Answer 3

引物设计原则你百度一下很多的；获得基因？设计好引物进行PCR克隆。然后酶切和连接载体。（选择有合适酶切位点的载体）；重组子筛选当然根据载体进行，比如蓝白斑啊，氨苄或者卡纳抗性啊，或者什么选择性培养基；IPTG诱导，当然时间和剂量要摸索；纯化的话很多种比如过柱子（要有His tag什么的)或者透析法。当然，WB也可以，顺便也检测了。够详细的了吧，看你这问题也是学生物的，这是基本操作呀~

Answer 4

神经生长因子