Question

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验步骤

Answer 1

1、PAGE胶电泳缓冲液配置
1）丙烯酰胺单体贮液：14.55g丙烯酰胺加上0.45g N，N'-甲叉双丙烯酰胺，先用40mL双蒸水搅拌溶解，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀至50mL，过滤。用棕色瓶4°C保存备用。
2)浓缩胶缓冲液贮液(0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8)：3.03gTris溶解在40mL双蒸水中，用4mol/L盐酸调pH6.8。再用双蒸水稀至50mL。保存在4°C备用。
3)分离胶缓冲液贮液(1.5mol/L Tris-HCl，pH8.9)：18.16gTris溶解在80mL双蒸水中，用4mol/L盐酸调pH8.9。再用双蒸水稀至100mL，保存在4°C备用。
4)10%（AP）过硫酸铵：0.1g过硫酸铵溶入1.0mL双蒸水，使用前新鲜配制。
5)电极缓冲液(0.025mol/L Tris，0.2mol/L甘氨酸，pH8.3)：15.14gTris加上72.07g甘氨酸，用双蒸水稀释到5L。可在室温保存一个月。
6）样品缓冲液（0.1mol/L Tris-HCl，pH6.8）：2ml浓缩胶缓冲液贮液加上1mL87%甘油、0.1mg溴酚蓝，用双蒸水稀释至10mL，可在-20°C保存6个月。
2、Native-PAGE配方 分离胶： 双蒸水 6.6ml 30%丙烯酰胺溶液 8.0ml 1.5mol/L Tris(pH8.8) 5.0ml 10%过硫酸铵溶液 (W/V) 200μl TEMED 15μl 浓缩胶： 双蒸水 6.8ml 30%丙烯酰胺溶液 1.7ml 0.5 mol/ LTris(pH6.8) 1.25ml 10%过硫酸铵溶液 (W/V) 100μl TEMED 10μl 3、Native-PAGE电泳
将玻璃板、胶垫、梳子用双蒸水洗干净，用酒精棉球擦拭，将电泳槽安装好，配制分离胶(12%)和浓缩胶(5%)如表1。过硫酸铵和TEMED最后加入，加入后聚合即开始，应立即混匀倒入两块玻璃板之间。分离胶倒入两块玻璃板间，应该留下适合的高度，使点样孔前端离分离胶有2.5cm左右的距离，在胶顶部缓缓加入约0.5cm高的双蒸水，待分离胶聚合完全后，倾去上层的双蒸水，用双蒸水清洗凝胶顶层，用吸水纸吸去残余的水滴。将浓缩胶倒入玻璃板夹层，插上梳子，待浓缩胶聚合完全后，拔去梳子，立即用双蒸水清洗点样孔。加入电极缓冲液，将样品用微量进样器点入点样孔底部，200伏电泳。当溴酚蓝到达分离胶时，电压改为250伏，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。将凝胶剥下，浸泡在100ml的底物液中，染色1小时，待胶带显色后立即照相。然后将凝胶进行常规的考马斯亮蓝染色。