Question

系统介绍一下GST-pulldown

Answer 1

GST亲和层析和GST Pull-down方法
此方法的基本原理是：利用重组技术将探针蛋
白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋
白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）
亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白
通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸
附而分离。在病毒受体研究中，融合蛋白通常设计
为病毒吸附蛋白（VAP）。这方面成功的例子有
HBV[28]。具体做法如下：将GST-融合探针蛋白
（VAP）和GTH-Sepharose制成亲和层析柱，然后待
分析的蛋白质混合液流经亲和层析柱，梯度洗脱，
分离、收集各蛋白组分，这称为GST亲和柱层析
（GST affinity column chromatography）。如果一开
始待检蛋白就和GST- 融合探针蛋白与
GTH-Sepharose一起共同孵育，经离心收集洗脱复
合物和洗涤后，再加入过量GTH获得相互作用蛋白
的复合物，那么这种方法则称为GST pull down。
GST亲和层析及相应的GST Pull-down方法的
优点是敏感，对混合物中的所有蛋白均“一视同仁”，
也可用于受体功能的鉴定。缺点是GST有可能影响
融合蛋白的空间结构，另外，蛋白质浓度对实验也
有一定影响。