Question

PCR引物设计中，引物上是否需要每个碱基都与模板链结合？

为了得到想要的Tm值，或是保证长度，不产生二聚体等，可不可以有在引物上添加一些不配对的碱基？
如下图：

可以的话，会对扩增有影响么？
如果不可以，为什么？

Answer 1

可以在引物上添加不配对的碱基，但是在引物的3‘端，至少有三个碱基是严格配对的。但是这样的操作主要是为了添加酶切位点或者flag等。
Tm值是根据两条链的退火情况来计算，不配对的碱基不算在内，所以你添加不配对的碱基对于Tm值几乎没有影响。
保证长度--没有必要添加不配对的碱基。
不产生二聚体--也没有必要，引物自身的碱基配对对于扩增影响不大，引物间的二聚体可以根据引物位置的选择来避免，无法避免时要保证3’端无配对。

所以不建议添加不必要的碱基来设计引物。（某些干扰实验除外）

Answer 2

引物上的碱基不是每一个都必须与模板链互补配对的，但是像你图上所示的那种设计是不行的，一般引物的5‘端可以完全不与模板一样，这样你可以在PCR中引物酶切位点等，但是3’端必须是与模板链结合的，因为Taq酶是按5-3方向延伸的，3‘端如果翘起的话，是不能延伸下去的，如果你的引物3’端一段与模板下游某处能结合，那就变成了deletion某段的PCR了

Answer 3

我觉得不一定需要，但是不配对的碱基数量要尽可能的少，而且关键位置如酶切位点或是活性位点等要尽可能保守。
引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。