Question

血液提取DNA的有关问题

1ML鹅血液提取DNA时，当我在加了10ul蛋白酶K， 裂解液消化过夜时，后来发现蛋白质特别多，请问下，是不是上面两种物质加少了。DNA提取时特别粘稠，很难取上清液怎么办？有什么好的处理方法？

Answer 1

1 材料和方法

　　1.1 样本来源 静脉抽取30份健康体检者血样。10份用EDTA抗凝, 10份不加抗凝处理，10份不抗凝在-40 ℃冻存2 a左右。

　　1.2 DNA提取方法 取凝血块，用9 g/L 氯化钠匀浆大约30 s，每换一个样本都要用70%乙醇和9 g/L 氯化钠清洗匀浆器以避免交叉污染。取匀浆后样本1 ml置于离心管中，室温8 000 r离心5 min后，去掉上层。血细胞在1 ml的Tris缓冲液I(10 mmol/L Tris�HCl，pH 8.0；10 mmol/L 氯化钾；10 mmol/L 氯化镁；2 mmol/L EDTA，pH 8.0；25 mL/L Triton X�100)中裂解10 min, 其间轻轻用力充分混匀, 室温10 000 r离心2 min，沉淀要用Tris 缓冲液I洗2次。将沉淀用220 μl的Tris 缓冲液II (10 mmol/L Tris�HCl，pH 8.0；10 mmol/L 氯化钾；10 mmol/L 氯化镁；2 mmol/L EDTA，pH 8.0；0.4 mol/L 氯化钠；10 g/L SDS)悬浮，轻轻振荡试管, 使底部细胞团块散开，在56 ℃保温15 min裂解。加入100 μl 5 M 氯化钠充分振荡沉淀去除蛋白质。10 000 r离心5 min，取上清。加2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA后，10 000 r离心5 min，弃上清。室温晾20 min左右待酒精挥发干净后以适量TE缓冲液(10 mmol/L Tris�HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA)回溶。EDTA抗凝血中DNA的提取从去掉上层开始。

　　1. 3 DNA浓度检测 用分光光度计在260 nm测DNA浓度。

　　1. 4 DNA纯度检测 DNA的纯度用A260/A280比值表示［3］。结果以均值±SD表示。

　　1. 5 DNA分子量检测 DNA样本的完整性用0.7%琼脂糖凝胶电泳证实，溴化乙锭染色，紫外灯观察。

　　1. 6 PCR检测 PCR扩增组织型纤溶酶原激活因子(t�PA)第8内含子Alu等位基因插入(I)和缺失(D)二态性［6］来评价DNA的可靠性。PCR引物序列如下：Alu1 5'�GTA AGA GTT CCG TAA CAG GAC AGC T�3', Alu2 5'�CCC CAC CCT AGG AGA ACT TCT CTT T�3'。反应体系组成为：10×PCR buffer 5 μl , 25 mM 氯化镁 6 μl , 10 mM each dNTPs 1 μl , 10 μM primer上下游各1 μl , DNA 2 μl ，Taq酶1 μl 。PCR反应程序为：95 ℃5 min预变性，然后94 ℃ 1 min ,58 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min循环40次，在72 ℃充分延伸10 min。

　　1. 7 结果 以均值±SD表示。

　　2 结果

　　凝血和抗凝血的DNA产量和纯度(A260/A280)相似。这些数据和用蛋白酶K处理及有机溶剂提取的相似［7］，比其他盐析程序报道的要高［1，5，7］，见表1。

　　表1 从冻存的和新鲜的凝血以及EDTA抗凝血中提取的DNA的浓度和A260/A280比值（略）

　　凝胶电泳显示所有样本的DNA分子量都很高(图1)，而且从两者的DNA样本中能很容易地扩增出t�PA基因的第8内含子区�Alu等位基因二态性(图2)。这些表明，此方法能有效地从血液中提取出基因组DNA。

　　图1 抗凝血、凝血和冻存凝血DNA提取比较。抗凝血DNA(1-2)、凝血DNA(3-5)和冻存凝血(6-8)DNA琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外分析。M－DNA Marker(λ�EcoT14 I digest, 购自TaKaRa)。（略）

　　图2 PCR扩增 t�PA 8th 内含子Alu等位基因插入/缺失(I/D)二态性结果。lane1、3、6为I/I；lane2为D/D；lane4、5为I/D。（略）

Answer 2

加入2mol的Nacl溶液，或将粘稠的DNA溶于体积分数为95%的酒精中。