Question

DNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？

Answer 1

一、DNA提取的完整步骤 ：

1． 取新鲜或冷冻样品的肌肉组织100ul-200ul或95%ALC保存的样品组织0.05g。 2． 将组织尽量剪碎，分别装入1.5ml 的离心管中。

3． 每管中加入450ul的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0; 100mM EDTA, pH8.0)

4． 每管加入10% SDS 50-100ul(70-80不定)  (1-2%),再加入2.5-5ul（3ul）蛋白酶K (20mg/ml)，使其终浓度达100ug/ml. 混匀，55℃ 3h至过夜（期间将管子颠倒几次）。

5． 样品中加入150ul NaCl（盐析作用），室温8000rpm离心20min，去沉淀，然后在上清液
中加入等体积（500ul）预冷异丙醇（沉淀DNA），混匀，20℃处理30min，14000rpm离心10min，去上清液。沉淀加70%ALC洗涤离心去ALC，室温挥发ALC5-10min，加TE 500ul，加10ul RNAase (终浓度4mg/ul)，即2.5ul。37℃ 30min 或65℃ 15min。

6． 加等体积酸液（提取DNA中的蛋白质）缓慢来回颠倒离心管10min，13000-15000rpm离心10min。用移液管（大口Tip头）小心取出上层相至另外干净的离心管中，不要触到两相之间的白色蛋白层（可视情况重复操作 次）。

7． 加入等体积酚：氯仿(催取酚)（1：1），轻摇,缓慢颠倒混匀10min 13000-15000rpm 离心5-10分钟，取上层清液于干净离心管中。

8． 加入等体积氯仿（氯仿：异戊醇（阻止氯仿挥发）=24：1），轻摇，缓慢颠倒混匀
10min,13000-15000rpm离心5-10min。取上清液加入1/10体积2M NaCl和等体积-20℃保存的无水乙醇（或等体积异丙醇）（沉淀DNA），沉淀DNA 10min,13000rpm离心5min，去上清，加入100-150ul70%ALC,离心，小心倒掉ALC（当心DNA沉淀丢失），用70%ALC再洗一次，然后去ALC。45℃烘箱烘干15-30min，用双蒸水沿管壁沿四周冲洗（TE量视DNA沉淀量而定，在80-250ul之间），溶解12-24h,-20℃保存备用。

二、注意事项：

1、 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。

2、 酚一定要碱平衡。苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。

3、 各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。

4、 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。

5、 异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。

6、 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。

7、 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。

Answer 2

DNA提取的完整步骤 ：
1． 取新鲜或冷冻样品的肌肉组织100ul-200ul或95%ALC保存的样品组织0.05g。 2． 将组织尽量剪碎，分别装入1.5ml 的离心管中。
3． 每管中加入450ul的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0; 100mM EDTA, pH8.0)
4． 每管加入10% SDS 50-100ul(70-80不定) (1-2%),再加入2.5-5ul（3ul）蛋白酶K (20mg/ml),
是其终浓度达100ug/ml. 混匀，55℃ 3h至过夜（期间将管子颠倒几次）。 5． 样品中加入150ul NaCl（盐析作用），室温8000rpm离心20min，去沉淀，然后在上清液
中加入等体积（500ul）预冷异丙醇（沉淀DNA），混匀，20℃处理30min，14000rpm离心10min，去上清液。沉淀加70%ALC洗涤离心去ALC，室温挥发ALC5-10min，加TE 500ul，加10ul RNAase (终浓度4mg/ul)，即2.5ul。37℃ 30min 或65℃ 15min。
6． 加等体积酸液（提取DNA中的蛋白质）缓慢来回颠倒离心管10min，13000-15000rpm离心
10min。用移液管（大口Tip头）小心取出上层相至另外干净的离心管中，不要触到两相之间的白色蛋白层（可视情况重复操作 次）。 7． 加入等体积酚：氯仿(催取酚)（1：1），轻摇,缓慢颠倒混匀10min 13000-15000rpm 离心
5-10分钟，取上层清液于干净离心管中。
8． 加入等体积氯仿（氯仿：异戊醇（阻止氯仿挥发）=24：1），轻摇，缓慢颠倒混匀
10min,13000-15000rpm离心5-10min。取上清液加入1/10体积2M NaCl和等体积-20℃保存的无水乙醇（或等体积异丙醇）（沉淀DNA），沉淀DNA 10min,13000rpm离心5min，去上清，加入100-150ul70%ALC,离心，小心倒掉ALC（当心DNA沉淀丢失），用70%ALC再洗一次，然后去ALC。45℃烘箱烘干15-30min，用双蒸水沿管壁沿四周冲洗（TE量视DNA沉淀量而定，在80-250ul之间），溶解12-24h,-20℃保存备用。

注意事项：
1、 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。
2、 酚一定要碱平衡。苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。
3、 各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。
4、 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。
5、 异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。
6、 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。
7、 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。

Answer 3

要看你是用哪种方法提取了，用试剂盒如凯杰，BIOG，天根都有详细说明书可以参考，试剂盒方便，产率也高，如果用其他方法要注意：

1、 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解.
2、 酚一定要碱平衡.苯酚具有高度腐蚀性,飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤,因此应注意防护.氯仿易燃、易爆、易挥发,具有神经毒作用,操作时应注意防护.
3、 各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解.
4、 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰.
5、 异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀.
6、 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理.
7、 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制.