Question

植物组织中DNA用什么方法提取与测定？

Answer 1

1． 称取2～5g 新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面，用滤纸吸干水分备用。叶片称重后剪成1cm 长，置研钵中，经液氮冷冻后研磨成粉末。待液氮蒸发完后，加入15mL 预热（60～65℃）的CTAB 提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65℃水浴保温，0.5~1h，不时地轻轻摇动混匀。
2．加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。
3．将锥形瓶中的液体倒入离心管中，在室温下4 000r/min 离心5min，静置，离心管中出现3 层，小心地吸取含有核酸的上层清液于量筒中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。
4．根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。
5．收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入1～2 倍体积预冷的95％乙醇，边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）迅速缠绕在玻棒上。小心取下这些纤维状沉淀，加1～2 mL 70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA 粗制品。
6．上述DNA 粗制品含有一定量的RNA 和其它杂质。若要制取较纯的DNA，可将粗制品溶于TE 缓冲液中，加入10mg/mL 的RNase 溶液，使其终浓度达50μg/mL，混合物于37℃水浴中保温30min 除去RNA。重复步骤2～5 的操作，可制得较纯的DNA 制品。
7．将DNA 制品溶于250μL 的TE 缓冲液中，完全溶解DNA 样品。
8．加入1/10 倍体积的3mol/L NaAc（pH6.8）和2 倍体积的95％乙醇，沉淀DNA，重复步骤5。最后，将DNA 溶于250μL 的TE 缓冲液中。
9．在751 型分光光度计上测定该溶液在260nm 紫外光波长下的光密度值。代入下式计算DNA 的含量。
结果计算

式中OD260nm 为260nm 处的光密度；L 为比色杯光径（cm）；0.020 为1μg/mL DNA 钠盐的光密度。
DNA 的紫外吸收高峰为260nm，吸收低峰为230nm，而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm。上述DNA 溶液适当稀释后，在751 分光光度计上测定其OD260nm、OD230nm 和OD280nm。如OD260nm/ OD230nm≥2OD260nm/ OD280nm≥1.8，表示RNA 已经除净，蛋白含量不超过0.3％。
附 注
如果植物样品不经液氮处理，提取液中的CTAB 浓度需要提高到4%（W/V）。在许多情况下，使用0.1%（V/V）巯基乙醇，并不能完全抑制叶片中的氧化作用，但是，这种氧化作用不会影响限制性内切酶的活性。如果使用的巯基乙醇浓度高于0.1%（V/V），则会大大降低DNA 的得率。
1．制备的DNA 在：（1）含有螯和剂如EDTA 中较稳定，因为EDTA 能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase；（2）在pH5～9 之间较稳定，否则过酸过碱会破坏DNA 的结构；
（3）有一定离子强度（强度越高, DNA 越稳定）的溶液中较稳定。
（TE 满足以上要求, 但如需对所得DNA 进行酶切, EDTA 浓度不可过高, 一般用0.1×TE 或0.2×TE）。
2．为了保证植物DNA 的完整性：（1）整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）；这样可防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解；（2）当DNA 处于溶解状态时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作要轻柔；在进行DNA 溶液转移时用大口（或剪口）吸管，尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏

Answer 2

脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L 的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。
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