Question

腐乳后期发酵是不是没有任何微生物？

如果说后期发酵的定义是，豆腐长毛之后盐腌和卤汤装瓶的过程。那么，各种微生物和酶真的能在高浓度的盐和抑制微生物生长的酒精中产生发酵作用吗？如果真的有微生物的话，能不能告诉我大概是什么品种呢？霉菌，酵母菌，细菌，我想这些应该都死光了吧。

Answer 1

腐乳发酵中的微生物前期发酵在豆腐乳白坯中采用纯培养的毛霉菌种。后期发酵在盐腌后装瓶或装坛加辅料时,加入混合酵母,加速后期发酵,缩短生产周期。
L-乳酸是一种重要的有机酸,广泛应用于食品、医药、农业和化工中,利用L-乳酸制备的聚L-乳酸是一种新型的可生物降解材料。细菌发酵和真菌发酵是发酵生产L-乳酸的主要方法,其中米根霉具有营养要求简单、可进行同步糖化发酵、产酸光学纯度高等优点,是工业化生产最有潜力的菌株之一。但是,目前米根霉发酵生产L-乳酸仍然存在发酵强度低、原料利用率不高、菌体形态难以控制等问题。 本文以米根霉AS3.819为生产菌株,以提高L-乳酸产率及发酵强度为主要目标,研究米根霉半连续高强度发酵产L-乳酸的关键技术。通过优化摇瓶发酵条件,进行米根霉菌丝球半连续发酵生产L-乳酸和罐发酵试验,建立其动力学模型,分析发酵中菌丝球的生长过程,并采用计算流体动力学(CFD)模拟技术对其发酵条件进行模拟优化。主要研究结论如下: (1)通过对种子培养条件及半连续发酵条件的优化,获得摇瓶中米根霉菌丝球半连续高强度发酵生产L-乳酸的控制模式:首批发酵中250 mL三角瓶装50 mL培养基,接种量10%,种子液32℃培养24 h,摇床转速200 r/min,发酵前期(0～36 h)温度为28～30℃,发酵后期(36～72 h)温度为32～34℃;重复批次发酵中每批发酵24 h。该发酵条件下,半连续稳定发酵30批,首批发酵菌丝球直径稳定控制为0.8～1.0 mm,其产酸能力较高,发酵强度为1.58g/(L·h),重复批次发酵强度2.67～3.00 g/(L·h)。 (2)研究3L发酵罐中发酵温度、搅拌转速及通气量对米根霉首批发酵产L-乳酸的影响,建立了米根霉菌丝球高强度发酵产L-乳酸的控制模式:发酵0～30h温度32～34℃、搅拌转速400 r/min、通气量1.5 L/(L·min),30～60 h温度34～36℃、搅拌转速300 r/min、通气量0.5 L/(L·min);该条件下,菌丝球直径稳定控制为0.9～1.2 mm,其产酸能力较高,发酵强度为2.51g/(L·h)。对重复批次发酵中葡萄糖质量浓度、温度、搅拌转速及通气量对发酵强度的影响进行研究,得到3L发酵罐中重复批次发酵生产L-乳酸的控制模式:补料培养基中葡萄糖质量浓度100 g/L,温度34～36℃、搅拌转速300 r/min、通气量0.5 L/(L·min),半连续发酵5批,每批发酵周期为20 h,发酵强度大于3.80g/(L·h)。 (3)补料培养基中N源及无机盐质量浓度对半连续发酵过程影响的研究表明,N源和无机盐是半连续发酵稳定进行不可缺少的因素:生物量在一定范围内增加,不能提高其发酵强度,在半连续发酵中间歇取出部分菌体保持DCW为10 g/L左右,可以维持高强度发酵。采用以上优化发酵条件,7 L发酵罐中米根霉半连续发酵生产L-乳酸25批,首批发酵强度为2.47 g/(L·h),第2～20批发酵强度3.40～3.85 g/(L·h),实现了米根霉半连续高强度稳定发酵生产L-乳酸。 (4)对米根霉半连续发酵产L-乳酸菌体生长、产物生成及底物消耗的动力学进行研究,发现重复批次发酵中每批产物生成及底物消耗曲线接近于直线。选择Logistic及Luedeking-Piret方程作为米根霉发酵产L-乳酸的动力学方程,运用Matlab软件将试验数据进行拟合,对方程中关键参数求解,建立米根霉半连续发酵动力学模型,并对模型进行验证。其中首批发酵动力学模型中X_m为7.6164 g/L、μ_m为0.1802 h~(-1)、α为3.2631、β为0.5980、p为1.9875、q为1.0232;重复批次发酵过程中,对初始菌体量及L-乳酸产量采用“零处理”方法,进行动力学方程求解,其中第2批发酵动力学模型中X_m为8.246 g/L、μ_m为0.0087h~(-1)、α为0.9610、β为0.4929、p为3.2438、q为1.0326,δ为98.63%;半连续发酵第2批到第10批,每批的生物量逐渐增加,菌体最大比生长速率逐渐减小,菌体重复利用效率逐渐降低但仍大于90%,最大比产物合成速率逐渐减小。验证试验表明建立的动力学模型能够很好的描述发酵过程(R~2≥0.98)。 (5)对摇瓶及发酵罐中菌体生长过程进行分析,菌丝球的形成过程为:孢子萌发成菌丝,菌丝凝聚在一起形成菌丝元,菌丝元生成具有致密菌核的菌丝球;发酵后期菌丝球内部逐渐形成中空核,且该中空核及菌丝球直径越来越大;重复利用多次的菌丝球逐渐破裂成菌片,菌片表面菌丝生长,大部分形成具有菌毛层的菌片,极少部分形成游离菌丝;菌片中心菌丝自溶衰亡形成具有中空核的菌囊;随着发酵的进行,菌囊由于其内部菌丝衰亡及流体剪切作用破碎成菌片。半连续发酵液中规则菌丝球、菌片、菌囊3种不同形态的菌丝球相互转变,其中规则菌丝球百分比逐渐降低,菌片及菌囊百分比逐渐增加;它们都具有较高的L-乳酸脱氢酶(LDH)活性,共同维持了半连续高强度发酵的进行。通过石蜡切片观察发现,具有致密菌核的菌丝球菌体代谢产酸能力较强;具有中空核的菌丝球壁外缘菌体细胞代谢活力旺盛。 (6)菌丝球大小对发酵强度影响比较明显,直径过大或过小的菌丝球产酸能力较低,直径为0.9～1.2 mm的菌丝球,产酸能力较高,有利于高强度发酵生产L-乳酸。 (7)采用CFD模拟技术对3 L发酵罐内不同转速的流体动力学进行模拟,建立3 L发酵罐中发酵工艺的CFD调控模式:首批发酵中剪切速度范围为0.009～1.582 m/s,重复批次发酵中剪切速度范围为0.009～1.192 m/s;根据该控制模式,优化7 L发酵罐中发酵条件,采用该优化发酵条件米根霉半连续高强度发酵生产L-乳酸20批,其中首批发酵强度为2.51g/(L·h),重复批次发酵强度为3.58～4.01g/(L·h);对50 L放大发酵罐的CFD模拟,确定了放大发酵条件,实际50 L放大发酵罐发酵试验中发酵产酸为94.56 g/L。 利用米根霉菌丝球半连续高强度发酵生产L-乳酸,增加了菌体利用率,节约了原材料、缩短了重复批次发酵周期、提高了发酵强度,为实现米根霉半连续高强度发酵生产L-乳酸的工业化奠定了良好的基础。