Question

食品卫生微生物学检验.大肠菌数测定

有哪位好心的朋友可以告诉我这个检验方法的具体内容和操作步骤呀，谢谢啦!

Answer 1

微生物
一、大肠菌群的检测GB4789.3-2010
第一法 大肠菌群MPN计数法 第二法 大肠菌群平板计数法

1.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤:称取35.6g溶于1000ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装于有倒立发酵管的试管中，每管10ml，121℃高压灭菌15min后备用。双料除蒸馏水外其他成分加倍。

1.2煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤：称取30g溶于1000ml蒸馏水中分装 ，经115℃15min高压灭菌备用。

1.3无菌生理盐水：称取8.5gNaCl溶于1L蒸馏水中。分装于250ml的锥形瓶中，121℃高压灭菌15min后备用
1.4结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）：称取41.6g溶于1L蒸馏水中，充分摇匀，加热煮沸2min冷却至50℃，倾注平板。

无菌 1 mol/L NaOH：称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。

无菌 1 mol/L HCl：移取浓盐酸90 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，121 ℃高压灭菌15 min。

二、大肠菌群的检测GB4789.3-2003 第一法 大肠菌群MPN计数法

2.1称取乳糖胆盐发酵培养基35.0g溶于1000ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装于有倒立发酵管的试管中，每管10ml，115℃高压灭菌15min后备用。双料除蒸馏水外其他成分加倍。

2.2伊红美蓝琼脂平板：称取伊红美蓝琼脂37.5g溶于1000ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装、115℃高压灭菌15min后备用。

2.3乳糖发酵管：称取乳糖发酵培养基35.0g溶于1000ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装于有倒立发酵管的试管中，每管10ml，115℃高压灭菌15min后备用

2.4无菌生理盐水：称取8.5gNaCl溶于1L蒸馏水中。分装于250ml的锥形瓶中，121℃高压灭菌15min后备用
2.5革兰氏染色按GB/T4789-2003中2规定。

Answer 2

GB4789.3—2010 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》

Answer 3

GB4789.3-2010，自己去找吧

Answer 4

第一法 大肠菌群MPN 计数法
6 操作步骤
6.1 样品的稀释
6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,
8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋
中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。
6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶
（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
6.1.3 样品匀液的pH 值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。
6.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液
或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌
吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释
1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。
6.2 初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3
管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36
℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续
培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
6.3 复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃±1
℃培养48 h±2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
6.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告
按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的
MPN值。
第二法 大肠菌群平板计数法
8 操作步骤
8.1 样品的稀释
按6.1进行。
8.2 平板计数
8.2.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐
水加入无菌平皿作空白对照。
8.2.2 及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心
旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平
板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
8.3 平板菌落数的选择
选取菌落数在15 CFU～150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。
8.4 证实试验
从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃
培养24 h～48 h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
8.5 大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g
（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取
其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105
CFU/g（mL）。