Question

求助Real-Time PCR的详细步骤及注意事项

Answer 1

实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差，提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果。
主要实验步骤如下：
1. 设计并合成Realtime PCR引物。
2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG（SYBR® Green）的PCR反应的优化。
3. 样品RNA抽提
a．实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。
b．实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。
4. RNA质量检测
a．紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度。
b．使用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。
5. 使用逆转录酶（Promega）进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。
6. 制备标准曲线样品：进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线
7. 标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中（其中TaqBeadTM热启动聚合酶来自Promega公司），进行RealTime PCR扩增和检测
8. 检测结果进行标准曲线分析，以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的
目的基因相对含量。

Answer 2

在做荧光定量PCR的时候用试剂盒比较方便。我们实验室之前用的BIOG荧光定量PCR试剂盒效果挺好的，反应很灵敏。最后实验做下来挺成功的。