Question

MicroRNA逆转录CDNA

参考别人的逆转录protocol完全没有看到RT引物的存在。我准备用takara的试剂盒进行逆转录,原试剂盒里的RT-primer Mix是什么?我的MicroRNA的引物是专门找人设计的，随便什么primer可以吗？

Answer 1

根据你的反转录引物而定。
①如果是普遍反转录引物，则不需要，也就是反转录用一种引物将RNA全部反转成cDNA
然后定量的时候再使用miRNA和对应的普通基因各自的定量引物。
②若使用的是特异性反转录引物
则需要分开反转录，前面的buffer、酶等能混合，最后要分开，加入各自对应的反转录引物。
无论是普遍反转录还是特异性反转录，均可进行后续的定量。貌似特异性引物更精确。

Answer 2

microRNA如果用茎环法进行逆转录，其逆转录引物和接下来的q-PCR的上游特异性引物是不一样的，可以找专门的公司设计和合成。我觉得你可以直接用一步法荧光定量PCR实验，这样逆转录和定量PCR就可以在一个反应管内完成，也降低了反应被污染的风险，我们实验正打算用BIOGHSC Super MultiProbe One Step Kit设计同时检测多个基因。