Question

检验食品中的大肠菌群需要注意的实验步骤有哪些？

Answer 1

食品微生物学检验大肠菌群计数：大肠菌群平板计数法（GB4789.3-2010）\x0d\x0a一试剂和仪器\x0d\x0a煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB肉汤）\x0d\x0a结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）\x0d\x0a恒温培养箱\x0d\x0a自动稀释仪\x0d\x0a均质器\x0d\x0a振荡器\x0d\x0a二样品处理\x0d\x0a固体样品应在无菌条件下充分粉碎。本次演示以乳粉为例，取密封状态良好的试样，备用待测。\x0d\x0a三检测过程\x0d\x0a实验前准备\x0d\x0a进入无菌操作室前应更换无菌实验服，戴帽子、口罩、无菌手套。进入无菌操作室后，首先用镊子夹取适量酒精棉全面擦拭双手，然后才能进行实验操作。\x0d\x0a酒精易燃，因此在擦拭双手的过程中应离开酒精灯火焰一定距离，防止出现危险，待手上的酒精挥发完全后，再进行实验操作。\x0d\x0a样品的稀释\x0d\x0a取一洁净无菌均质袋于自动稀释仪上，用酒精棉充分擦拭样品袋，将剪刀置于酒精灯外焰上充分灼烧，小心剪开样品袋。将称样勺于酒精灯外焰灼烧片刻，准确称取25g样品于无菌均质袋中。用酒精灯外焰灼烧注水口片刻，在盛有样品的均质袋中注入225mL无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液。取下均质袋，将均质袋放入拍击式均质器中，用均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。\x0d\x0a注意：样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时可用1mol/L无菌氢氧化钠或1mol/L无菌盐酸溶液调节。\x0d\x0a均质完毕后，做好标记，将均质袋置于样品框中。\x0d\x0a在装有9mL生理盐水的无菌试管上做好标记，用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入装有9mL生理盐水的无菌试管中，稀释前后试管口都应在酒精灯上灼烧片刻。加塞后于振荡器上混合均匀，制成1:100的样品匀液。同理，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。稀释样品时，注意吸管或吸头尖端不得触及稀释液面；每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。\x0d\x0a接种及培养\x0d\x0a在事先经灭菌处理的培养皿底部做好标记。根据对样品污染状况的估计，选取2～3个适宜的连续稀释度。本次演示只做1:10和1:100的样品稀释液。\x0d\x0a用无菌吸管吸取1:10样品稀释液1mL，加入到培养皿中，备用。同理，加入1:100稀释液和空白液。注意，每个稀释度应接种2个无菌培养皿，空白液即为以1mL生理盐水代替1mL样品稀释液。\x0d\x0a加完样品梯度稀释液后，即可倾倒培养基。倾倒前应将锥形瓶的瓶口在酒精灯上充分灼烧。灼烧后及时倾注15mL～20mL结晶紫中性红胆盐琼脂于每个培养皿中，小心旋转培养皿，将培养基与样液充分混匀。倾注培养基时应将锥形瓶口尽量伸入培养皿内，防止倾倒时培养基挂在培养皿的内壁或外壁上，且倾倒过程应果断，防止培养基沿锥形瓶外壁流出、滴落。培养基的温度以46℃为宜，不能过高或过低，温度过高不利于操作且对菌体有害，温度过低培养基迅速凝固，菌体不能在培养皿内均匀的分布，导致菌落计数困难。转动培养基时用力须均匀，防止培养基沾到培养皿上盖或洒出。\x0d\x0a倒完培养基后，静置培养皿，等待培养基冷却凝固。\x0d\x0a待培养基凝固后，再加3mL～4mL结晶紫中性红胆盐琼脂覆盖平板表层。加两次培养基的主要目的是：使菌体均在培养基内部生长，以便于观察典型菌落形态。等待培养基冷却凝固。待培养基凝固后，翻转平板，置于培养箱中于36℃±1℃条件下培养18h～24h。\x0d\x0a平板菌落计数\x0d\x0a选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落，其中典型菌落的特征为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。\x0d\x0a证实实验\x0d\x0a先在煌绿乳糖胆盐肉汤管上做好标注。将接种环置于红外灭菌器中灭菌，再用接种环从结晶紫中性红胆盐琼脂平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于煌绿乳糖胆盐肉汤管内，振摇均匀。每次接种后都应及时将接种环在灭菌器中灭菌。将接种完的煌绿乳糖胆盐肉汤管置于培养箱中，于36℃±1℃条件下培养24h～48h。培养完毕后，观察煌绿乳糖胆盐肉汤管中产气情况。凡管内倒管有气泡者，即可报告为大肠菌群阳性。