生物化学问题

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游医明达
2022-11-12 · TA获得超过2606个赞
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分类: 教育/科学 >> 科学技术
问题描述:

请教。ATP和AMP怎么区分。鉴别

实验

解析:

在pH4.8电泳缓冲液条件下,带有不同量磷酸基团的AMP、ADP、ATP解离之后,带有负电荷量的顺序为:ATP>ADP>AMP,它们在电场中移动速度不同,从而得到分离。又利用核苷酸类物质的碱基具有紫外吸收性质,将分离后的电泳醋酸薄膜放在紫外灯下,可见暗红色斑点,参照标准样品在同样条件下的电泳情况,对混合试样分离后的各组分进行鉴定。

三、仪器与试剂

1.仪器

(1)电泳仪、电泳槽(平板式)

(2)紫外灯

(3)电吹风、医用镊子

(4)醋酸纤维素薄膜(8 cm×12cm)

(5)微量进样器(10μL或50μL)

2.试剂

(1)柠檬酸缓冲液(pH4.8):称取柠檬酸8.4g,柠檬酸钠17.6g,溶于蒸馏水,稀释到2000mL。

(2)标准腺苷酸溶液:用蒸馏水将纯AMP、ADP、ATP分别配成100mg/10mL溶液。其中AMP需略加热助溶。置冰箱备用。

(3)混合腺苷酸溶液:分别取上述标准液AMP、ADP、ATP各1份等量混匀。置冰箱备用。

四、操作步骤

1.点样:将醋酸纤维素薄膜放入pH4.8柠檬酸缓冲液中,待膜完全浸透(约0.5h)后用镊子取出,夹在清洁的滤纸中间,轻轻吸去多余的缓冲液,仔细辨认薄膜无光泽面,用微量进样器在无光泽面上点样。点样点距薄膜一端1.5cm,样点之间距离1.5cm。点样量为2~3μL,按少量多次原则分2~3次点完。

2.电泳:向两个电泳槽内注入pH4.8的柠檬酸缓冲液,缓冲液的高度约为电泳槽深度的3/4。(注意:两槽中电泳液面一致)。用宽度与薄膜相同的滤纸作“滤纸桥”连接醋酸纤维素薄膜和两极缓冲液。待滤纸全部被缓冲液浸湿后,将已点样薄膜的无光泽面向下贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上。

点样端置于负极方向,盖上电泳槽盖,接通电源,在电压降为10V/cm的条件下进行电泳,一小时后关闭电源,取出醋酸纤维素薄膜,用电吹风吹干。

3.鉴定:用镊子小心地将吹干的薄膜放在紫外灯下观察,用铅笔划出各腺苷酸电泳斑点,并标明各斑点的腺苷酸代号。

绘出三种标准核苷酸及样品的电泳图谱,以标准单核苷酸的迁移率作标准,鉴别试样中各组分。

五、附 注

1.电泳前,一定要检查电极正负极与薄膜方向,确定负极接在薄膜的点样一端,因为样品是带负电荷,接通电源后,样品要在薄膜上向正极泳动;确定薄膜的无光泽面朝下。

2.点样时,要控制点样点的大小在直径为2~3mm,样点不可太大,否则电泳后观察结果不理想。
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