Question

蛋白质N端和C端的测定方法是什么？基本原理是什么？

在做生物化学作业，希望知道的人告诉我，要快哦，不会的请不要随便乱回复！谢谢！

Answer 1

(1)N-末端测定
　　A.二硝基氟苯法(FDNB,DNFB)：1945年Sanger提出此方法，是他的重要贡献之一。
　　DNP-氨基酸用有机溶剂抽提后，通过层析位置可鉴定它是何种氨基酸。Sanger用此方法测定了胰岛素的N末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸。
　　B.氰酸盐法：1963年Stank及Smyth介绍了一种测定N末端的新方法,步骤如下：
　　由于乙内酰脲氨基酸不带电荷，因此可用离子交换层析法将它与游离氨基酸分开，分离所得的乙内酰脲氨基酸再被盐酸水解，重新生成游离的氨基酸，鉴别此氨基酸即可了解N-末端是何种氨基酸。
　　C.二甲基氨基萘磺酰氯法：1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法，采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯,简称丹磺酰氯。它与游离氨基末端作用，方法类似于Sanger的DNFB法，产物是磺酰胺衍生物。
　　丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧光。此法优点为灵敏性较高(比FDNB法提高100倍，样品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP氨基酸高)，可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定。
　　(2)C-末端分析
　　A.肼解法：这是测定C-末端最常用的方法。将多肽溶于无水肼中，100℃下进行反应，结果羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放，而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼。
　　这样羧基末端氨基酸可以采用抽提或离子交换层析的方法将其分出而进行分析。如果羧基末端氨基酸侧链是带有酰胺如天冬酰胺和谷氨酰胺，则肼解时不能产生游离的羧基末端氨基酸。此外肼解时注意避免任何少量的水解，以免释出的氨基酸混淆末端分析。
　　B.羧肽酶水解法：羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。

Answer 2

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一种简便的蛋白质N端氨基酸测定方法

第二军医大学学报2000年第21卷第3期

张平武 魏林 项洪刚 孙树汉

关键词：氨基酸序列；氨基酸N端

蛋白质（或多肽）的两端氨基酸序列测定是分析未知蛋白质的结构和功能的基础。目前蛋白质N端序列分析的技术已较为成熟，可达20～40个氨基酸残基，但由于N端氨基酸序列分析成本高(1400～4 000元/次)，不大可能反复多次检测。有些多肽N端氨基酸是封闭的，降解后才能进行氨基酸序列分析。如果事先知道N端氨基酸是否封闭，一方面有利于选择序列分析的方式（N端、C端或降解后测序），另一方面可节省费用，也利于测序结果的分析。一个结构未知的酵母分泌蛋白，其相对分子质量为7.9×104，我们在分析其结构时采用DNS-Cl法对其N端氨基酸进行了测定，知其N端未封闭，然后进行氨基酸序列分析，取得了很好的效果。

1 材料和方法

1.1 样品和试剂 经SephadexG100和DEAE-52柱层析纯化后的酵母分泌蛋白质〔1〕，相对分子质量为7.9×104，其他为国产分析纯试剂。

1.2 反应 取400 μg纯化蛋白质，溶于50 μl (0.2 mol/L)的NaHCO3溶液，用1 mol/L NaOH调pH 10.0，加去离子水定容至250 μl。在一小指管内加入上述溶液及200μl DNS-Cl丙酮液（2.5 mg/ml）,石蜡膜封口，40℃温育55 min。真空抽干2 h。在管内加入0.2 ml 6 mol/L HCl后将管口密封，10℃水解反应12 h。真空抽干后加入2滴0.2 mol/L NaHCO3,并用1 mol/L HCl调pH至2.5，加入乙酸乙酯5滴，稍加摇动,DNS-N端氨基酸即在乙酸乙酯层〔2〕。

1.3 两相层析 在聚酰胺薄膜上点样,第一相甲酸∶水（1.5∶100），第二相苯∶冰乙酸（9∶1）层析。

2 结 果

2.1 DNS-Cl法测定N端氨基酸 在紫外灯下（253 nm）观察，可见聚酰胺薄膜上有3个色斑点：左下角的蓝色斑点为DNS-OH，左上角的黄绿色斑点为DNS-氨基酸，右边的蓝绿色斑点为DNS-NH2。由于薄膜上只有一个黄绿色的DNS-氨基酸斑点，可以确定该蛋白的N端是均一的，没有封闭，对照标准的层析图提示末端残基可能为天冬氨酸或精氨酸，从而可以进行N端氨基酸自动分析（图1）。

Answer 3

蛋白质N端和C端的测定方法是什么？基本原理是什么
二硝基氟苯法(FDNB法)
2、二甲基氨基萘磺酰氯法(DNS-Cl法)
3、异硫氰酸笨酯法(Edman法)
C-末端分析1、肼解法
2、还原法