Question

如何防止提取过程中RNA的降解

Answer 1

通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。0T3z(F&_,D6c%^"h6YA6_RNA提取的一般步骤-O:Y+x$p#s8U4M9S所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。(O(g;^+K)f+i&]%P实验步骤：*l&d6s5e(q1F(g2|j,^0s破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。6D8}.Q;Y,g*X1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。"s%f,`0[1d*m!]0e2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。&X.P)i)Y;L#u/[3、沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或异丙醇。2@0d&z7?+i,g1@4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。3@%V"o9v+I1J2o9k"z5、融解RNA一般使用TE。;L5f.n6}(S1t%Z&J6、保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。&P3[7m*^$U$_"?:F"xu*N(?(I氯化锂法提取总RNA："u;}'I!r'^'^&l本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺陷。#~*S:}9`*r4Z3P试验试剂："d$r6Q+_.I8Q1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M)尿素、360g(6M)加水至1L，过滤灭菌】7_8w1t"o9a'q!i4Z2、悬浮液【10mM?Tris-HCL(pH7.6),1mM?EDTA(pH8,0),0.5%SDS】!m8Q4R,]&y:b#`7d试验步骤：7[6?$`*};o7_Z'{1、对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。&Y)b:E,Q"l/^Q:\$s2、匀桨液在0－4℃放置4小时后，12000g离心30分钟。x-C6D-N/N0K!t2a3、取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤2。)y-x)S0K9y6j,e4、沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。3d2v'i1~(~*D5、取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心。L4a'Q4u"l:a*K%Z$?(e6、70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。3};r0[/Q'G9q7、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。0f.X%R(H%B7g!y7j5u$C'|)[%~!J3D:Q蛋白酶－热酚法6|"^0b*[)P3S*c4b4H4l本方法适合于病毒RNA的提取*I(i+b#r!K试验试剂：$?4[7H9`)J1、蛋白酶K（终浓度50ug/ml）,J5pl6V/t7[/I2、2×缓冲液：1%SDS?20mMTris-HCL(pH7.6)?0.2MnaCL9h,p]y+\$Z)O试验步骤：#W3v8G1[$]5y1、提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K,37℃40-50分钟。-K0p/E'G0M#Q-z7n,{#d2、加入等体积65℃预热的酚溶液，轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭。w!`;W(~,E:i3^3、离心，取上清，氯仿抽提一次。,|(Z0d;j2@7m+d2Q&xH4、取上层水相，加1/10倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，－20℃放置1小时，5000g离心(10000g,10min)。7[/w,h2d6U$k5、70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。%A5Y;{(w%]3a*y,Oe)P6、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于－70℃保存。植物RNA提取过程中难点的相应对策植物RNA提取过程中难点的相应对策)o5B7d/Q3_酚类化合物的干扰及对策：a9D*Z3K?7W许多植物组织特别是植物的果实（如苹果、樱桃、李子、葡萄等）和树木类植物中富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多。在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应（browningeffect）。被氧化的酚类化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。但Newbury等发现RNA提取的难易程度与材料中酚类物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA的提取。但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质（如原花色素类物质）是影响RNA提取的一类化合物。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其与RNA分开。9b0S!}0U6|9k/l!v"vg1~/@防止酚类化合物被氧化的方法："v;y,a4k7n/Z1、还原剂法：一般在提取缓冲液中加入(-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸来防止酚类物质被氧化，有时提取液中(-巯基乙醇的浓度可高达2％。(-巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su等认为在过夜沉淀RNA时加入(-巯基乙醇（终浓度1％）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠（NaBH4）是一种可还原醌的还原剂，用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减，醌类化合物可被还原成多酚化合物。&H.z.p+~&t%t5G&G1M-P/q!u2、螯合剂法：螯合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而可以与PVP或不溶性的PVPP形成稳定的复合物，使原花色素类物质不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步骤中被除去。用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素，在pH8.0以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低〔11〕。当原花色素类物质量较大时，单独使用PVPP无法去除所有的这类化合物，因而需要与其它方法结合使用。p%N0w/t7r3、Tris-硼酸法：如果提取缓冲液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以与酚类化合物依*氢键形成复合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合。这一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取缓冲液中不再加入其它还原剂。但如果Tris-硼酸浓度过高（＞0.2M）则会影响RNA的回收率。#p8]0^8K3a4、牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原－抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会，因此提高了RNA的产量。BSA与PVPP结合使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性。)~#H/y(P7Q)j4G*w1G8l5、丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料，可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA。@+?-X/V9z8T8H:B3C!W'C酚类化合物的去除：&z#h)G0H&]$I1N"f.l9N通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。与PVP、不溶性PVPP或BSA结合的多酚，可以直接通过离心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提时除去。Manning利用高浓度的2-丁氧乙醇（50％）来沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％2-丁氧乙醇的缓冲液洗涤RNA沉淀以去除残留的多酚。他认为即使多酚被氧化，其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，无需再用NaBH4来处理。5C6Y8a1SV:`2~多糖的干扰及对策：6I-b3R4~$T&O多糖的污染是提取植物RNA时常遇到的另一个棘手的问题。植物组织中往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携走了，造成RNA产量的减少；而在沉淀RNA时，也产生多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液。由于多糖可以抑制许多酶的活性，因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常规的方法中，通过SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多糖；在高浓度Na+或K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通过LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中。但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖与RNA混杂在一起，所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA分离纯化时多糖污染的问题。7['X/e,d8x(B-p(|9C&n用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度10％～30％，可以使多糖沉淀下来，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的匀浆液中加入乙醇，如Lewinsohn等在从裸子植物的木质茎中提取RNA时，在匀浆上清液中加入乙醇至终浓度10％以沉淀多糖。但Tesniere等在从葡萄浆果组织中提取RNA时，是在用CsCl超离心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入终浓度30％乙醇来沉淀多糖的，进一步纯化了RNA样品。!i5b5m*z9G8M4~-N/D另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉组织的RNA时在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花组织的RNA时加入的是1/5体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花叶和花粉的RNA时是加1/3体积的8.5M醋酸钾（pH6.5）溶液到匀浆液中以除去多糖等杂质。在提取某些植物材料的RNA时，是将上述两种方法结合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA时，是在匀浆液中加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M醋酸钾溶液以去除多糖杂质。Su等在去除褐藻的多糖时，单独使用乙醇或醋酸钾都无效，只有两者结合使用效果最佳。6c9|5q1b9[5l1s+nFang等认为缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松树RNA时，缓冲液中NaCl的浓度为2.0M和1.0M，通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA将RNA与多糖分离。Manning是将胡萝卜种子等材料苯酚提取后的上清液稀释，调节Na+离子浓度至80mM，然后加入0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖。3B1h#M'{+{0U%U,K2@,v蛋白杂质的影响及对策：$@-G5o(f1s9_2V*G2n/^蛋白质是污染RNA样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质。常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取缓冲液中含有蛋白质变性剂，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等，这样在匀浆时可以使蛋白质变性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。'T7v(F1J9@+EWilcockson利用蛋白质与RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70％高氯酸钠溶液中，RNA的溶解度大于蛋白质的溶解度，因而将大部分蛋白质沉淀下来。接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇，这时RNA能沉淀下来而能溶于70％高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中。这样可以除去绝大部分的蛋白质。3qe/\*I"A&@次级代谢产物的影响及对策：:N3|)NfK#n;p'f6h0J2A0{从植物组织中提取高质量RNA的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA的分离。因不能确定这些次级产物具体是什么物质，所以，目前还没有什么特殊的方法来解决这个问题。Baker等综合Hughes等的选择性沉淀法、Chirgwin的氯化铯梯度离心法和Iversen等的RNA回收方法纯化了松树种子、成熟松树针叶等植物组织的RNA。(Ms5O%f!H-Q*\(m"`(}由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织RNA的提取相对于其它生物材料来说要困难的多。实践中经常会发现，即使同一种植物的不同组织其RNA提取方法会有很大的不同；含有某种干扰因素的不同植物材料，其适用的RNA提取方法可能不同；即使是同一种植物同一种组织材料，但来源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一样。所以，对于某一植物或其组织来说，其相应的RNA提取方法必需经过摸索和实践才能确立。#S0a#G7L3S&A随着植物分子生物学研究领域的拓宽，可以肯定地说，在作为其研究基础的植物材料RNA提取过程中还会出现新的难点，但随着不断地探索和经验的积累，科学工作者们一定会迅速地解决这些难点，为植物分子生物学的发展铺平道路。植物RNA提取中的一些特殊方法植物RNA提取中的一些特殊方法$e*[2U(E%h'[多酚类植物的RNA提取：!j!d,]2V(R!B&o苹果棉花等多酚类植物提取RNA用TRIZOL一般提不出来。这个方法是验证过有效的,提取的RNA纯度不是特别高,但是用作northern足够。6j&d2u(\6W8_&o4E1X1t实验试剂：#s7s8H!R#W1y#g提取buffer200ml：NaCl1.1688g100mMTris2.4228g10mM(tris-HCl8.0)EDTA5.8450g10mMSDS2.0000g1%NaOH调至8.0,定至200ml,加200ulDEPC融解.*j)s;t2@)t4W'F试验步骤：!Ta0I*C(w5S"E*A'W1、1.5ml离心管用液N2冷冻吼加入0.1g样品,立即加入500ul酚氯仿,再加入500ul提取buffer,剧烈振荡1-2min,冰上放置5min。"F3S0V5@0s7i1T2、4度12000rpm离心15min,上清转入新管,加氯仿异戊醇抽提一次。)H'L7d#d"y8@3、取600ul异丙醇,-20度沉淀20min.&w:m2r:I4\4l#J4、12000rpm离心10min。!I.Y.\8b7A5、沉淀用70度乙醇洗。k!T.D1[0w+?)_0D5?6、8000rpm5min。"A;y#}'F(`5}6I+N!x7、沉淀晾干,溶于30ulDEPC水。;^0Q-R+`5j(n'['m9M#m/r3o2O!T6z$`1m&e.^银杏等木本裸子植物的RNA提取方法：&Ai&V!H0`?6R银杏、香机等木本裸子植物，酚类和多糖等次生物质含量较多，对RNA的分离和纯化有很大干扰，严重影响了提取RNA的质量和产量，给相关的分子生物学实验的进行带来阻碍。目前，RNA的提取方法很多，采取常规的Trizol试剂盒、SDS等方法不能提取银杏RNA，而ShujunChang等(1993)的CTAB法，提取RNA质量也较差，降解也十分严重。对其提取步骤进行改进，得到质量较高的银杏RNA样品。/s4i*Vk8S)x试验试剂：!]!M(q#E7N3t;`#i.m([1、1Mtris:12.11gTris，溶于60mL水中，用浓盐酸调至Ph8.0，定容至lOOmL.用灭菌的DEPC水溶解。`4c9{)p2\4t2、500mMEDTA:18.61gEDTA"H2O加入80mL水中，搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0，定容至100mL。;V#x*j!H4y!G4M#q3c5P3、10mol/LLiCL:42.4gLiCL,100mL水溶解即可。9i)@a'\&w+cp*g4、提取缓冲液(DEPC水处理):2%CTAB（蛋白质变性剂）.2%PVPK30（去除多酚类物质）100mMTris-HCL(Ph8.0)25mMEDTA（金属鳌合剂）2.0MNaCL（去除多糖和CTAB）配法:2gCTAB,2gPVP,10mL1mol/Ltris,5mL500mMEDTA,11.7gNaCL,定容到100mL。)o+\5E!X;O#A(M+P8H*K9n0q5、亚精胺(提取时加少量)（RNA酶抑制剂）#J9g6O/h(u'd6、4%0一疏基乙醇(提取时加)（去除多酚类物质）'De,d(J.K$z!O9f7、氯仿异戊醇(24:1)（抽提蛋白质）)U)A+]4\#Q8、10MLiCL（沉淀大分子RNA）7M+b)g4J4m5C0f-\9、SSTE（溶解RNA）1.0MNaCL0.5%SDS1mMEDTA(PH8.0)10mMTrisHCL(pH8）配法:2.9gNaCL,0.25gSDS,0.5mL1Mtris,100uL500mMEDTA,pH8.0,定容至50mL。.m5z+J3X0V&\6e7Y#R试验准备：;_5z9}"f%q6t1、研钵和玻璃器皿用锡纸包好，200℃以上向温烘烤2小时以上，或180*C高温烘烤4小时。;X7n3w,W2}9M2、塑料制品(枪头和离心管)最好用新的，并且用报纸包好，121'C高压灭菌，灭菌40min，或连续两次121'C高压灭菌，每次灭菌20min，然后用烘箱烘千。;X*f+~,v7}.a3、所有溶液配制好后，加DEPC水使DEPCuJ浓度为0.1%,37℃过夜，1211C高压灭菌40min.(其中Tris因为不能用DEPC处理，所以Tris用DEPC处理的水溶液灭菌后配制。))x&B,{%e"^&F:s0q试验步骤："Y6U+`2C*\4X2a#r【根据文献(ShujunChang,1993)CTAB法，稍作改进。】;F^+e9I#h/Q7m*A*]1、将4mL提取液加入到lOmL离心管c卜650C水域加热。$D+?4w7\3J:w,M2、用液氮冷却研钵，在研钵中加入少量的抗氧化剂PVP，取1g低温冷冻的银杏叶片，迅速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中叶片融化，充分研磨后，立即加入到预热好的提取缓冲液中，用手摇功混匀。6C4i+L/Z*C5G)v3、65℃，水域1min后冷却至室温。(N2@)U:S,{9M"e8f4、加入等体积(4mL)的氯仿:异戊X17(2=L:1)，混匀，10000rpm,40C，离心10min。(H6Po1y8p#?5、小心吸取上清液，加入等体积(4mL)的仿:异戊醇(24:1),混匀，10000rpm,40C,离心10min。.{#k/z5r:x:v1x6、吸取上清液，加1/4体积的IOMLiCL,混合，4℃沉淀过夜，然后10000rpm离心20min。7xP4o6z1D![8}7、用枪吸干，用500uLSSTE溶解沉淀，转到1.5mL离心管.加等体积氯仿:异戊醇混匀，10000rpm,40C，离心10min。,H2b7C1d*[6r4c8、离心吸取取上清液，加两倍体积的无水乙醉，-70℃沉淀至少30min，或一200C下沉淀2h。"W*c'Y1P-t5K)^,`9、12000rpm,40C,离心20min，去上请用70%的乙醇洗两次，吹干沉淀。1x,S*X0V"y6F/l10、用40uLDEPC处理的水溶解沉淀，得到RNA样品。8f2C-S4R3O9R4Te&{11、除用于电泳和紫外检测外，其余RNA-70℃冰箱保存备用。Q0o7V.]9x,{1i:__!U*X1m5G9A(W%U改良Krapp提取法：1r)r#s3~|.q1v.w试验试剂：'C7Z1^)J5A&f&W(Kd1、RNA抽提掖：母液：4mol异硫氰酸胍20mmolEDTA20mmolMESpH7.0。工作液：取400ml母液加入1.7ml2-ME贮存在4℃条件下备用。/a.I$E.RS%z2、RNA重悬液：2molLiCl10mmolNaAc调整终体积为250ml，pH5.2，灭菌后贮存在4℃条件下备用。2u;J1S9V8a.j试验步骤：)O/o,L#q-D8v)U1、取新鲜植物材料0.5~1g，冷冻干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入10mlRNA抽提掖充分混匀。7nQ:B"SN9B!J$u2、4℃条件下8000rpm离心10min，将上层水相转移至一干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿抽提掖，在4℃条件下8000rpm离心10min。1N:K+]3R"a7`3、上清液转移至一干净离心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混匀后，在4℃条件下8000rpm离心10min.）。$p+y,P/^-w/E'g"k0y:[4、小心将上清液转移至另一干净离心管中，加入1/10vol3molNaAc和2vol冷无水乙醇，在-80℃条件下沉淀2小时。:t&M8O1O!C-w5a5、在4℃条件下8500rpm离心30min.，小心弃去上清液，沉淀重悬于RNA重悬液中，置于4℃条件下1小时。9b7Z#K4v(y%l8Q0a8N)I%|6、4℃条件下8500rpm离心10min.，弃去上清液，沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。检测后分装，置于-70℃条件下保存。

Answer 2

如何去除RNA提取过程中的蛋白质污染提取RNA时如何去除DNA的污染的方法：注意实验室的标准化问题，注意污染的存在，同时严格按照说明书上的操作应该没有问题。发现DNA污染，用DNAseI消化1小时，37度离心取上清的时候，一定要小心不要取到中间的膜和下面的液体。直接加NaOH溶液与提取液混合搅拌,然后离心就可以了.因为RNA可溶于NaOH溶液,而DNA不可溶,离心后的上清液就不含有DNA了。RNA提取步骤：1.匀浆处理：①组织将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1mlTRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。②单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。③细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1mlTRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。2.将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3.可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。4.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。5.2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。6.把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。7.2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。8.用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1mlTRIzol至少加1ml75%乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。9.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可。不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5%SDS，用枪头吸打几次，55-60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。注意事项：从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800mlTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μgRNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75%酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10μg，肾3-4μg，骨骼肌和脑组织1-1.5μg，胎盘1-4μg，上皮细胞8-15μg，成纤维细胞5-7μg。

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我觉得RNA在提取过程中并不是很容易降解，匀浆可以用匀浆器，机械打磨的效果可能要比手工去 匀浆要高效一点。
我用的也是Tripure或trizol，所以并不太清楚应该怎么配试剂，下面的方法可以一试。
total RNA提取
Total RNA extract
1. cell Sample (50mg)+lysis (denaturation liquor) 0.5ml + β巯基乙醇1.6ul，充分混匀，此液体可放于-20℃保存1-2 months。组织则先进行匀浆。所有操作均在4℃进行。
2. +平衡酚（饱和酚）500ul (pH 4.0)，充分mixture for 3min
3. 2M 醋酸钠 50ul，混匀（pH5.2）
4. 氯仿/异戊醇 （49：1） 100ul，上下颠倒混匀
5. 冰浴 15min
6. 4℃ 13000rpm for 10min
7. 吸上清；加氯仿/异戊醇 500ul，摇匀2min
8. 12000g (13000rpm) for 10min
9. 吸上清，加异丙醇 500ul，混匀，-20℃沉淀20min以上
10. 12000g (13000rpm) for 10-15min
11. 弃上清，75%乙醇（4℃）500ul，洗沉淀
12. 12000g (13000rpm) for 10min
13. 弃上清， 37℃烤箱5min，或室温干燥
14. 取适量水溶RNA（1*TE）
15. –20℃或-70℃保存
Reagents
1 变性液
异硫氰酸胍 23.632g
柠檬酸钠 0.3676g
十二烷基肌氨酸钠 0.25g
+ H2O 至 50ml
2．2M 醋酸钠
8.2030g NaAC +ddH2O, 以HAC调pH至5.2, 加水至50ml
3．氯仿/异戊醇 （49：1）
4． 75%乙醇
From our lab
Result:
260/280=1.9左右
关键点：吸取水相时宁少勿多
本方法优点：简便，不需kit，费时少，费用低，细胞组织均适合，不需超高速，对大多数实验均适合
缺点：不能一步分离出蛋白质和DNA。不过我曾想同时抽提DNA，但没试过，但理论上是可行的。

Answer 4

灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于180 ℃干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次， 并于100℃干烤15分钟（Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
羧甲基化的RNA在无细胞体系中翻译效率很低，然而，除非其中大部分嘌呤碱基均被修饰，否则其形成DNA：RNA或RNA：RNA杂交体的能力并不明显降低。用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％DEPC处理水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。

Answer 5

降解方法可以用Takara，两步法先把RNA转为CDNA，然后再PCR，这样不需要每次提RNA，也可以一步法加入TotalRNA。处理细节：提取的时候，用到的器具需要DEPC的水处理后高压。去除外源性的RNA酶对实验影响，用Trizol的话，分层取小心吸取，宁少取。电泳时可以用无RNA酶的水配制的TBS，然后150v，10min，若电泳时间长，产生的热也容易使RNA降解。同时电泳也可以说明蛋白质去除是否完全。