Question

pcr结果出不来，每次都是只有100bp以下的条带，没有其他的条带

不管是扩gapdh，还是目的基因，都是只在100bpmarker下有一个条带，其他地方没有任何条带，扩的gapdh应该在200bp左右，RNA纯度分析每次结果都很好的，260/280都在2.0附近。pcr体系是50ul：10xbuffer 5ul Mgcl2 5ul 2.5的dNTPs 4ul 10umol/l的引物个1ul cDNA 2ul 。94度 30秒 58度30秒 72度40秒 共40个循环。昨天换了新鲜组织刚扩了一个目的基因一个gapdh，两个都是只有一条100bp下的条带，且目的基因的这个条带比较粗亮。我该从哪里找问题？还有用的各种试剂-20度如果过了半年了，是不是已经过期？

Answer 1

首先试剂应该没有问题，现在连作为marker的基因都扩不好，那么一个是你的引物有问题，另一个就是反转录出问题了。遇到这样的问题应该一步一步的排除。
首先确定反转录没有问题，一般的鉴定办法是扩增marker基因，但是你现在gapdh多不出来，要么你就换一个基因试一试，比如actin，或者你直接用随机引物试一试，看看反转录后的产物是否有模糊成片的电泳条带。
如果没有问题，那就看看是不是引物问题，要么是引物没有设计好，要么就是引物稀释时间有些长了，重新稀释。
再然后就可能是PCR条件的问题，比如我做20ul体系的时候，Mg2+用的是1.2-1.4ul，Mg2+浓度越大，扩增的非保守性越多。再看，退火温度合不合适，是否有些高，做一个温度梯度试验可以解决这一问题。
也不知道你做的是什么生物，PCR程序还可以适当的调整，如果扩增不出来，可以试一试tuckdown的方法
在PCR反应体系使用普通的rTaq（Takara），如果不行，可以将buffer换成G buffer试一试，不要一上来就用特别保守的酶。
另外，100bp一下的那个条带，基本上可以认为是引物二聚体，说明你的引物合成的有问题呀！