Question

PCR操作时注意事项

Answer 1

太多了，比如一定要有阴性对照，防止污染带来的假阳性；退火温度的设置等等

Answer 2

1. PCR引物设计：
引物设计可能是PCR扩增成功最关键的因素。如引物设计欠佳，可能导致扩增产物不足，甚至扩增失败，其原因是设计欠佳的引物可导致非特异扩增和/或形成引物二聚体，此又成为PCR反应的竞争性产物，从而进一步抑制PCR产物形成。
在引物设计时必须考虑以下几个因素，其中最重要的是引物长度、溶解温度(Tm)、特异性、引物序列互补问题、G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸、3’-末端序列等。
(1)引物长度：由于PCR反应的特异性、退火温度以及时间均至少部分与PCR引物长度相关联，因此引物长度是PCR扩增是否成功关键的因素。一般PCR引物长度为15-30核苷酸。
(2)溶解温度(Tm)：因加热而断开H键，使双链DNA分开或“溶解”为单链DNA。溶解温度(Tm)即指使一半双链DNA变为单链DNA的温度。Tm可采用下列公式计算：Tm＝2(A+T) + 4(G+C)。
需注意PCR反应至少有两个(一对)引物，两个寡核苷酸引物Tm 值应比较接近，不可差异过大。因有较高的Tm值的引物在较低的反应温度时可发生错配，而引物Tm值较低，反应温度较高时则可能不能发生作用，因此如引物的Tm值差异较大，可导致PCR扩增效率低下甚至扩增失败。
(3)引物序列互补：设计引物时应绝对没有3个碱基以上的内引物配对，如引物有这样具有自我配对的区域，“弹回”即部分双链结构将发生在退火反应时。
(4)G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸：待选择的引物序列应尽可能是碱基随意分布，G+C含量平均-避免长A+T和富含G+C的区域。在引物的碱基组成中GC含量一般为45％-55％。在选择的引物序列中应没有多G 或多C延伸，因其可促进非特异性退火，多A 和多T延伸也应避免，因其可“呼吸”和使引物－模板复合物展开延伸，降低扩增的效率。同时多嘧啶(T,C)和多嘌呤(A,G)延伸也应被避免。
(5)3’-末端序列：为控制引物错配，应认真地确定PCR引物中3’末端的位置。
总而言之，应重视PCR引物设计，设计PCR引物时应认真小心。对于一个成功的PCR来说，几个重要因素如引物长度、GC含量和3’序列必须优化。理想的引物应为差不多随意分布的核苷酸混合、GC含量50％、长度约为20个碱基，因此能使Tm值处于56-62ºC范围。分析靶基因潜在引物位点时，应考虑无单聚合体, 没有明显的二级结构形成的倾向，不自我互补，与其他双链靶基因序列没有明显的同源性。为避免枯燥无味的设计，节省时间，减少错误，可应用计算机程序优化设计、选择、确定寡核苷酸引物。

追问

谢谢！

追答

不用谢