Question

RNA以质粒为载体生产胰岛素的过程及原理

从人的胰岛素细胞中分离并纯化得到胰岛素的RNA，设想用此RNA以质粒为载体，利用E.coli为人类生产大量胰岛素，请详细叙述此方法生产胰岛素的原理及过程。
要求：
从基因工程入手，重点讨论复制、转录、翻译及逆转录。

Answer 1

利用胰岛素RNA与E．coli大量生产胰岛素简述
一． 胰岛素rna的提：1.取材，目前，猪的胰岛素是应用最广泛的胰岛素（与人的胰岛素只相差一个氨基酸），因此可以大量取材于猪的胰脏。2.提取，可以用裂解法提取rna。
二． 胰岛素rna的纯化：对于，大量的rna，利用有机溶剂抽取提法可以提纯，并且利用电泳法检。
三． 植入：提取的rna要与质粒融合导入E．coli中，因此，rna要通过逆转录成dna并且与质粒结合，导入E．coli。1．逆转录，逆转录所需要的原料是四种脱氧核苷酸即为：A，T，C，G。另外，还需要逆转录酶，在模拟环境下进行逆转录。通过逆转录，我们由胰岛素rna获得胰岛素的全部基因。2．质粒融合，先得用同样的限制性核酸内切酶处理质粒，产生和人胰岛素基因片段相同的黏性末端（也可能是平末端），然后将两DNA分子用DNA连接酶结合在一起。关于运载体，首先需要有多处限制酶切点，然后还需要有一段标记基因，最后需要有能在受体细胞内稳定存在、自我复制并表达的能力。大肠杆菌内含质粒（独立于细菌本身的DNA，存在于细胞质内的小型环状DNA分子），且满足以上条件。将组装好的质粒植入E．coli。
四． 复制：进入E．coli的质粒需要经过数次的复制才能在胞体内形成规模的，有效地应用的胞体。因此，我们需要把通过这些种方式获得胞体，经过数次的繁殖，获得需要的胞体。质粒在胞体内的复制是以A，T，C，G为原料，在dna聚合酶，以及dna解旋酶等酶的存在下进行的。dna的复制特点是　a，半保留复制，即母链解旋，并且以每一条子链为模板进行自我复制。b，双向复制，dna复制时，从起点向两个方向解旋形成复制叉，复制叉的两个方向同时复制。c，不连续复制，dna的复制总是沿着5＇～3＇端复制，因此，在复制叉中，总有一条子链（随从链）在其母链dna解旋到一定程度的时候，再的复制，然后再解旋，再复制，直到复制完毕。E．coli的复制方式还有边解旋边复制的特点。
五． 经过，数次的复制，我们得到了大量，且较纯净的含有猪胰岛素基因的E．coli。下一步就是让基因表达，就能得到大量的胰岛素。1，转录，E．coli的转录的以dna的一条子链为模板转录的。产物链从5＇～3＇端延续。转录的所需要的原料是核苷酸既：A，C，G，U。所需要的酶为dna解旋酶，rna聚合酶，rna连接酶，还需要启动因子，转录因子，启动因子，ρ因子等。2，翻转录的产物为mRNA，并移动到核糖体上进行翻译，翻译还需要一种rna成为转运rna（tRNA）．mRNA与核糖体结合以后，tRNA携带氨基酸与之结合，经过一系列的反应产生肽链，肽链经过加工修饰后变成具有活性的蛋白质，即胰岛素．
经过上述，可实现用胰岛素RNA与E．coli大量生产胰岛素。

Answer 2

得到的RNA反转录成cDNA，将cDNA的完整ORF区连接到表达载体上，记得连接上起始因子。然后导入E.coli（一般是BL21），就可以获得蛋白了。

Answer 3

逆转录，得到cDNA，然后PCR得到序列，连接到表达载体中，转化到E.coli, 根据载体进行诱导表达，得到表达产物。

Answer 4

亲.现在才问.早点就好啦

Answer 5

你是潍坊医学院的？